miR-486对胶质瘤干细胞的抑制作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.014

摘要/Abstract

摘要：

背景：既往研究发现，miR-486在胶质瘤干细胞(CD133⁺)中的表达水平显著低于其在胶质瘤非干细胞(CD133^-)中的表达水平，但是miR-486对CD133⁺细胞的影响尚不明确。
目的：探索miR-486对CD133⁺细胞的作用。
方法：利用流式细胞分选将U87胶质瘤细胞中分为CD133⁺和CD133^-细胞。通过脂质体转染构建miR-486过表达的胶质瘤干细胞。
结果与结论：流式细胞分选和纯化获得高比率的CD133⁺胶质瘤干细胞。实时反转录PCR检测发现miR-486在CD133⁺胶质瘤干细胞的表达水平比CD133^-胶质瘤细胞明显下降。脂质体转染成功构建miR-486过表达的胶质瘤干细胞，体外实验发现miR-486高表达抑制胶质瘤干细胞的增殖，将其阻滞于G₁/S期，并促进凋亡。提示miR-486对胶质瘤干细胞具有抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胶质瘤干细胞, CmiRNA, miR-486, CD133⁺胶质瘤细胞, CD133^-胶质瘤细胞, 增殖, 凋亡, 细胞周期

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-486 in glioma stem cells (CD133⁺) is significantly down-regulated compared with that in glioma non-stem cells (CD133^-), but the effect of down-regulation of miR-486 on CD133⁺ cells remains unclear .
OBJECTIVE: To explore the effect of miR-486 on CD133⁺ cells.
METHODS: CD133⁺ glioma stem cells and CD133^- glioma cells were separated from U87 cells by flow cytometer. miR-486 overexpression glioma stem cells were constructed by lipofection transfection.
RESULTS AND CONCLUSION: After sorting and purification, the content of the CD133⁺ fraction was enriched up to 83.5%. The expression level of miR-468 in CD133⁺ glioma stem cells was obviously down-regulated compared with that in CD133^- glioma cells. CD133⁺ glioma stem cells overexpressing miR-486 were fabricated successfully. Results from in vitro experiments showed that miR-486 overexpression could dramatically decrease the proliferation of glioma stem cells, induce a cell cycle arrest in G1/S phase for CD133⁺ glioma stem cells and promote cell apoptosis. These findings suggest that miR-486 can be a suppressor of glioma stem cells, which offers a novel potential therapeutic target for glioma stem cells and human glioma.

Key words: Brain Neoplasms, Glioma, MicroRNAs, Cell Cycle, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 5

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引言

胶质瘤是成年人颅内最常见，杀伤力最大的肿瘤，具有发病率高、易复发、侵袭性生长、肿瘤组织内部细胞异型等特点^[1-2]。尽管外科手术以及放化疗技术不断提高，但胶质瘤患者的生存期仍止步不前。近10年胶质瘤患者的中位生存期多为9-12个月，甚至更少^[3-4]。
大量研究表明除了胶质瘤细胞本身较强的增殖能力和侵袭性外，在胶质瘤中还存在着一小群肿瘤起始细胞，具有自我更新、无限增殖、多系分化的特点，被称为胶质瘤干细胞^[5-7]。很多研究者认为胶质瘤干细胞才是胶质瘤发生、复发和转移的根源，也是导致胶质瘤有较差预后的根源^[8-11]。因此，寻找靶向治疗胶质瘤干细胞的方法显得尤为重要。
MicroRNAs(miRNAs)是一类小的内源性非编码单链RNA分子，可通过与目标mRNA的3’端非翻译区的碱基序列部分或完全配对降解目标mRNA或者阻断其翻译而发挥其生物学作用^[12-14]。生物信息学分析结果表明，miRNAs调控人体60%以上的基因^[15]。多种miRNAs已经被报道参与胶质瘤的发生，如miR-29a，miR-29c，miR-195，miR-200a，miR-181a，miR-181b，miR-26a和miR-218^[16-22]。一些miRNAs也被认为参与胶质瘤干细胞的增殖、分化和凋亡等，有成为靶向干预胶质瘤干细胞靶点潜力，这些miRNA有miR124，miR-137，miR-34a，miR-125b和miR-451等^[23-26]。
miR-486作为一种新发现的miRNA，在多种肿瘤中发挥重要的作用^[27-28]。既往研究显示，miR-486在胶质瘤干细胞的表达水平显著低于其在胶质瘤非干细胞中的表达水平，但是下调的miR-486对胶质瘤干细胞的影响却尚未有报道^[26]。
胶质瘤干细胞表面会表达一些特异的抗原分子如CD133，可以利用CD133免疫表型进行流式细胞分选或者免疫磁珠分选，将胶质瘤干细胞(CD133⁺)和胶质瘤非干细胞(CD133^-)分开^[29]。本实验采用流式细胞分选技术从U87胶质瘤细胞系中分离出CD133⁺细胞，通过脂质体转染构建过表达的miR-486胶质瘤干细胞，观察miR-486对肿瘤干细胞的作用。

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2014年3月至2015年3月在南阳市中心医院病理实验室完成。
1.3 材料 U87胶质瘤细胞系购自中科院上海细胞研究所。miRNA模拟物对照和miR-486模拟物购自西安沃尔森生物技术有限公司。
1.4 方法
1.4.1 胶质瘤细胞系的培养将U87胶质瘤细胞(1×10⁶)接种于含DMEM-高糖培养基的25 cm²培养瓶中，然后置
于37 ℃、体积分数5%CO2恒温培养箱中培养，每三四天传代1次。

取对数生长期U87细胞置于干细胞培养液(DMEM/ F12培养基中加入20 ng/mL 表皮生长因子；2% B27补充剂；20 ng/mL碱性成纤维生长因子)中继续培养，每两三天换液1次，培养2周后用于后续实验^[30]。
1.4.2 CD133⁺胶质瘤干细胞分选将培养瓶中的U87胶质瘤细胞进行消化离心，重悬后计数。取1×10⁷个胶质瘤细胞放置于80 μL冰浴的HBSS缓冲液中，然后添加FcR阻断剂20 μL阻断Fc受体，孵育10 min；接着添加10 μL CD133/2(293C3)流式分选抗体，混匀，4 ℃避光孵育 10 min。2 mL HBSS缓冲液冲洗细胞，洗去未结合的抗体，并在低温离心机中2 000 r/min离心10 min。
将离心得到的细胞重悬在1 mL冰浴的HBSS缓冲液中，使用BD FACSAria II进行流式分选^[31]。
1.4.3 CD133⁺胶质瘤干细胞纯化标记CD133/2 (293C3)流式分选抗体的胶质瘤细胞进行分选后，将分选后的细胞接着标记CD133/1 (AC133)-PE流式抗体，使用流式细胞仪ACSCalibur检测分选后的细胞纯度^[31]。
1.4.4 实时反转录PCR检测miR-486的表达按照Trizol使用说明书提取CD133⁺和CD133^-细胞的总RNA，使用紫外分光光度计测定浓度。然后按照Taqman MicroRNA反转录试剂盒使用说明进行反转录合成cDNA，将cDNA加入到Taqman MicroRNA Real-time PCR试剂盒，在实时PCR仪上进行定量。
采用2^-??Ct方法分析miR-486在不同细胞中的相对表达水平^[30]。
1.4.5 细胞转染将胶质瘤干细胞以1×10⁶/孔的密度接种于6孔培养板中，培养24 h后，严格按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染，每孔添加100 μL转染试剂混合物miRNA模拟物对照(miR-control)或miR-486模拟物(miR-486 mimics)，转染24 h后更换新鲜的干细胞培养液，48 h后用于后续的实验^[30]。
1.4.6 MTT检测细胞增殖取转染miRNA模拟物对照和miR-486模拟物的胶质瘤干细胞，以2×10³/孔的密度接种于96孔板后加入无血清培养液，置于37 ℃，体积分数5%CO₂的恒温培养箱培养4 d。每天检测细胞含量，每孔先加入10 μL(5 g/L)的MTT溶液，37 ℃继续孵育4 h，然后换液，每孔加入150 μL二甲亚砜，放入摇床中轻微振荡直至完全溶解MTT转化生成的紫色甲臜。之后用酶标仪检测各孔在570 nm处的吸光度。
1.4.7 流式细胞仪检测细胞周期收集转染miRNA模拟物对照和miR-486模拟物的胶质瘤干细胞(1×10⁶)，用PBS清洗2次，体积分数75%乙醇固定，置于4 ℃冰箱中过夜。次日在测定细胞周期前，PBS清洗2次，RNaseA酶(终质量浓度50 mg/L)37 ℃孵育30 min。PI(50 mg/L)避光染色 15 min，使用流式细胞仪检测。
1.4.8 流式细胞仪检测细胞凋亡取转染miR-486模拟物和miRNA模拟物对照的胶质瘤干细胞用于实验。严格按照Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书进行操作，将细胞(2×10⁵)加入到100 μL 1×Binding缓冲液重悬，添加2.5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染料，振荡混匀，暗处放置10 min，然后用流式细胞仪检测，计算凋亡细胞数量。
1.5 主要观察指标 miR-486在CD133⁺和CD133^-细胞中的表达差异，转染miR-486模拟物的CD133⁺细胞与转染miRNA模拟物对照的CD133⁺细胞的增殖、细胞周期以及凋亡的差异。
1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。实验结果用x±s表示。组间差异采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤干细胞被假设为存在于肿瘤组织中的很少一部分干细胞样的群体，因其大多处于相对静止状态，使其对化疗药物及反射治疗不敏感而导致在各种治疗之后肿瘤还易复发。肿瘤干细胞理论解释了在传统治疗过程中多数肿瘤细胞被杀死，而肿瘤干细胞因其具有抗凋亡蛋白如Bax/Bcl-2及ABC转运体仍可存活；又因其具有自我更新、无限增殖和多系分化的能力，故在治愈一段时间或临床好转后，仍可出现肿瘤转移与复发^[32-35]。所以，治疗肿瘤的关键在于对肿瘤干细胞的治疗。
胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，具有高的浸润性、侵袭性、易复发、预后差的特点，成为神经外科治疗的一个难点^[36-38]。即使行联合手术、放化疗等治疗手段，患者的生存率也没有得到明显的提高^[39-40]。Singh等^[7，41]从人类晚期恶性胶质瘤中分离出CD133⁺细胞，发现其能够无限增殖，并将其植入到NOD/SCID小鼠脑中，发现微量的CD133⁺胶质瘤干细胞(100个)就能够引发肿瘤的发生，又进一步实验将CD133⁺胶质瘤干细胞形成的肿瘤细胞进行分离，再次植入NOD/SCID小鼠脑中，又见新肿瘤的发生，其表型也与亲代肿瘤相同，这表明了胶质瘤干细胞具有无限增殖和致瘤的能力。因此根据肿瘤干细胞理论，胶质瘤干细胞是胶质瘤生长和复发的根源，治疗胶质瘤干细胞是治疗胶质瘤的关键。近年来发现，一些miRNAs参与了胶质瘤干细胞的增殖，分化和凋亡等。Silber等^[23]发现过表达miR-124或者miR-137抑制胶质瘤细胞增殖，促进其分化。Guessous^[24]发现过表达miR-34a可以抑制胶质瘤干细胞的增殖，促进其分化成神经元和神经胶质细胞。miR-125b也被报道通过靶向CDK6和CDC25A，抑制胶质瘤干细胞增殖，诱使细胞周期阻滞^[25]。Gal等^[26]报道了miR-486在胶质瘤干细胞中的表达显著下调。但是关于miR-486对胶质瘤干细胞的影响，目前尚未有报道。本实验中，采用CD133抗体标记进行流式细胞分选、纯化得到胶质瘤干细胞。通过实时反转录PCR检测发现miR-486在CD133⁺胶质瘤干细胞的表达水平相比于CD133^-胶质瘤细胞明显下降，这与Gal等^[26]报道的结果是一致的。通过脂质体转染成功构建miR-486过表达的胶质瘤干细胞，体外实验发现miR-486高表达抑制胶质瘤干细胞的增殖，将其阻滞于G₁/S期，并促进凋亡。这些结果表明miR-486对胶质瘤干细胞起到了抑制作用，有望成为靶向治疗胶质瘤干细胞的靶点，从而抑制胶质瘤的生长，这也为以后深入研究miR-486对胶质瘤干细胞以及胶质瘤生物学特性的影响奠定了基础。

文章快阅

延伸阅读

1实验设计构思介绍：
胶质瘤是成年人颅内最常见，杀伤力最大的肿瘤，具有发病率高、易复发、侵袭性生长、肿瘤组织内部细胞异型等特点。除了胶质瘤细胞本身较强的增殖能力和侵袭性外，在胶质瘤中还存在着一小群肿瘤起始细胞，具有自我更新、无限增殖、多系分化的特点，被称为胶质瘤干细胞。很多研究者认为胶质瘤干细胞是胶质瘤发生、复发和转移的根源，也是导致具有较差预后的根源。因此，寻找靶向治疗胶质瘤干细胞的方法显得尤为重要。microRNAs(miRNAs)是一类小的内源性非编码单链RNA分子，可通过与目标mRNA的3’端非翻译区的碱基序列部分或完全配对降解目标mRNA或者阻断其翻译而发挥其生物学作用。既往研究显示，miR-486在胶质瘤干细胞的表达水平显著低于其在胶质瘤非干细胞中的表达水平，但是下调的miR-486对胶质瘤干细胞的影响却尚未有报道。因此采用流式细胞分选技术从U87胶质瘤细胞系中分离出CD133⁺干细胞，并检测miR-486在CD133⁺和CD133^-细胞的表达，接下来通过脂质体转染构建过表达的miR-486胶质瘤干细胞，研究miR-486高表达对胶质瘤干细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响，进而探讨其在肿瘤干细胞中所发挥的作用。
2国内外同类研究水平的介绍：
多种miRNAs已经被报道参与胶质瘤的发生，如miR-29a，miR-29c，miR-195，miR-200a，miR-181a，miR-181b，miR-26a和miR-218。一些miRNAs也被认为参与胶质瘤干细胞的增殖、分化和凋亡等，有潜力成为靶向治疗胶质瘤干细胞的靶点，如miR124，miR-137，miR-34a，miR-125b和miR-451。
3与其他同类研究的比较：
miR-486在胶质瘤干细胞的表达较少已有报道，但是关于miR-486的作用及分子机制目前未有报道。