人脐带间充质干细胞对异位子宫内膜细胞增殖及凋亡的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.013

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞可以分泌多种细胞因子和生长因子，促进周围细胞的存活，发挥旁分泌作用。
目的：探讨人脐带间充质干细胞对异位子宫内膜细胞增殖及凋亡的影响。
方法：分离培养人脐带间充质干细胞和异位子宫内膜细胞，以异位子宫内膜细胞单独培养作为对照组，人脐带间充质干细胞与异位子宫内膜细胞共培养作为观察组。培养24，48，72 h时采用MTT法检测异位子宫内膜细胞增殖情况，流式细胞仪检测异位子宫内膜细胞凋亡情况，RT-PCR检测异位子宫内膜细胞PTEN基因表达情况。
结果与结论：与对照组比较，培养24，48，72 h时观察组异位子宫内膜细胞增殖受到显著抑制，亚二倍体峰占细胞总数的比例显著升高(P < 0.05)。随着时间的推移，观察组细胞抑制率逐渐下降，各时间点比较差异有显著性意义(P均 < 0.05)。与同期对照组比较，观察组细胞PTEN基因表达显著上调(P < 0.05)。培养48，72 h观察组细胞PTEN基因表达显著高于培养24 h (P < 0.05)。以上结果表明人脐带间充质干细胞可以通过上调PTEN基因表达，抑制异位子宫内膜细胞增殖，并促进其凋亡。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 子宫内膜异位症, 脐带间充质干细胞, PTEN基因, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells can secrete a variety of cytokines and growth factors that promote the survival of surrounding cells and play a paracrine role.
OBJECTIVE: To investigate the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on the proliferation and apoptosis of ectopic endometrial cells.
METHODS: After isolation and culture, human umbilical cord mesenchymal stem cells and ectopic endometrial cells were co-cultured as observation group, and ectopic endometrial cells cultured alone served as control group. At 24, 48, 72 hours of culture, the proliferation and apoptosis of ectopic endometrial cells were detected by MTT and flow cytometry, respectively; RT-PCR was used to measure the expression of PTEN gene in ectopic endometrial cells.
RESULTS AND CONCLUSION: At 24, 48 and 72 hours, the proliferation of ectopic endometrial cells in the observation was inhibited significantly as compared with the control group, and the hypodiploid peak ratio also increased significantly (P < 0.05). Over time, the cell inhibition rate was gradually declined, and there were significant differences at different time points (all P < 0.05). Compared with the control group, the expression of PTEN gene was up-regulated significantly in the observation group (P < 0.05). In the observation group, the expression of PTEN gene at 48 and 72 hours was significantly higher than that at 24 hours (P < 0.05). These findings indicate that in the human umbilical cord mesenchymal stem cells can inhibit the proliferation of ectopic endometrial cells in vitro and promote their apoptosis by up-regulation of PTEN mRNA expression.

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Endometriosis, Coculture Techniques, PTEN Phosphohydrolase, Cell Proliferation, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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Wang Chun-mei, Li Jie, Sun Wen-ping, Wu De-hui . Effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells on proliferation and apoptosis of ectopic endometrial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.013.

图/表（结果） 5

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2013年9月至2014年12月在青海医学院完成。
1.3 材料 ①经临床诊断，确诊为子宫内膜异位症患者30例，年龄30-65岁，平均年龄(34.25±3.15)岁，均接受手术治疗。术中取病灶处组织，用于培养异位子宫内膜细胞。②脐带组织来自足月剖宫产健康新生儿，在获取标本之前，均征得产妇及其家属的同意，签署同意书。
1.4 实验方法
1.4.1 人脐带间充质干细胞的分离培养取足月妊娠分娩新生儿脐带组织，置于添加青霉素、链霉素、DPBS的培养皿中，剪成15 cm左右长的片段。用DPBS反复冲洗，加入胰酶消化。消化结束之后利用移液枪将细胞转移至离心管中，添加15倍体积DPBS进行离心，离心结束弃掉上清。用DPBS平衡液清洗，收集细胞，进行原代和传代培养。采用流式细胞仪对第3，4代细胞表型进行鉴定，将其应用于后续实验。

1.4.2 原代异位子宫内膜细胞的分离及培养无菌条件下剪碎异位内膜组织，添加0.1% Ⅳ型胶原酶进行消化，并进行细胞重悬，然后接种于培养瓶中，添加10 g/L胰岛素+5.0 mL体积分数为10%胎牛血清+工作浓度双抗高糖DMEM培养液，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中。培养2 d之后首次换液，清除未贴壁细胞，之后每隔两三天换液1次，倒置显微镜下观察细胞的生长情况。
1.4.3 细胞分组与共培养单独培养异位子宫内膜细胞，设为对照组。人脐带间充质干细胞与异位子宫内膜细胞，共同接种在Transwell培养板上下室，设为观察组。
1.4.4 异位子宫内膜细胞增殖情况取培养24，48，72 h的异位子宫内膜细胞并进行消化，接种在96孔培养板，每孔添加20 μL MTT，培养4 h后添加二甲基亚砜，利用酶联检测仪检测增殖细胞数目。
1.4.5 细胞周期及细胞凋亡率检测取培养24，48，72 h异位子宫内膜细胞并进行消化，PBS清洗之后利用乙醇悬浮固定，置于4 ℃环境下过夜，PBS洗涤去乙醇，离心获取细胞，加入PI避光显色，流式细胞仪检测细胞周期以及坏死和凋亡的细胞数。
1.4.6 RT-PCR法检测子宫内膜细胞PTEN mRNA表达取培养24，48，72 h的异位子宫内膜细胞，PBS洗涤后添加RNAiso Plus，吹打使细胞发生脱落溶解，然后转移至EP管，并添加氯仿。静置后离心，将上清液层转移至新的EP管中，并添加异丙酚。静置之后离心，去掉上清液，用乙醇对管壁进行洗涤之后离心。置于室温环境下干燥沉淀，添加RNase-free水，置于-80 ℃条件下保存。对提取到的子宫内膜细胞内总RNA进行反转录和扩增，并电泳处理。
1.5 主要观察指标 ①人脐带间充质干细胞形态及细胞表型检测结果。②异位子宫内膜细胞形态。③异位子宫内膜细胞增殖和凋亡情况。④异位子宫内膜细胞PTEN基因表达。
1.6 统计学分析所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，计量资料予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

子宫内膜异位症是指内膜细胞种植在不正常的位置而形成的一种常见妇科疾病^[8]。内膜细胞本该生长在子宫腔内，但由于子宫腔通过输卵管与盆腔相通，使得内膜细胞可经由输卵管进入盆腔异位生长^[9-10]。长期以来，这种性质良性，但行为却类似恶性的疾病一直是临床治疗的难点。
对各种生物的生命活动而言，细胞凋亡与细胞和组织的基本特征等息息相关^[11]。经过大量研究发现，子宫内膜异位症的发生以及发展与细胞凋亡之间存在十分密切的联系^[12-15]。Gebel等^[16]研究报道，与正常的子宫内膜组织比较，子宫内膜异位症患者的内膜组织自发性凋亡吸光度显著下降。异位的内膜组织自发性凋亡吸光度显著低于在位的内膜组织，且这一情况的出现与周期之间没有任何关联。
人脐带间充质干细胞可以通过旁分泌机制，调控细胞的生物学活性。干细胞实际上是人体发育进化的最小单位^[17]。从受精卵开始，人体的干细胞就已经出现了，此后，经过自我复制，逐渐分化出组织细胞，形成胚胎^[18]。在组织修复方面，间充质干细胞的作用主要体现在3个方面：①替代作用，可以诱导分化为很多组织细胞，修复替代损伤的组织。②旁分泌效应，可以分泌很多的细胞因子，这些因子可以参与组织的修复^[19-20]。③具有较强的黏附性，低密度培养时能够迅速贴壁，具有快速增殖能力，体外具有多向分化潜能。本实验经传代培养的人脐带间充质干细胞可以形成典型的单层成纤维细胞。MTT法检测观察组的异位子宫内膜细胞增殖均受到显著抑制，另外随着时间的推移，观察组细胞抑制率逐渐下降。流式细胞仪检测发现处于S期的异位子宫内膜细胞数量显著下降，从G1期进入S期之后，细胞受到明显的抑制。通过研究还发现，观察组的亚二倍体峰占细胞总数比例低于同期对照组。上述结果表明，在人脐带间充质干细胞的影响下，异位子宫内膜细胞增殖受到抑制，细胞凋亡显著增加。
PTEN基因是沉默第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白，是一种重要的抑癌基因，并具有磷酸酶活性^[21-24]。PTEN是重要的抑癌基因，PTEN蛋白既可通过拮抗PI3K/AKT通路影响肿瘤细胞增殖和生长，也可直接进入细胞核内维持基因组稳定性，在肿瘤抑制过程中发挥重要作用[25-28]。越来越多的研究提示PTEN基因除抑制肿瘤外也参与神经、代谢等多项生物功能的调控^[29]。PTEN基因作用于多个癌症相关蛋白，因此，当PTEN去除蛋白磷酸盐，它是作为一种肿瘤抑制基因，以预防癌症^[30]。PTEN基因既可利用传统的AUG编码启动子合成PTEN蛋白，也可利用新型编码启动子CUG合成新亚型PTENα蛋白^[31]。以往Harada等^[32]和Mutter等^[33]也同样认为PTEN基因在子宫内膜异位症中发挥出十分重要的调控作用。本实验结果显示观察组细胞PTEN基因表达显著上调，且培养48，72 h PTEN基因表达高于24 h，这表明随着异位子宫内膜细胞凋亡的增加以及增殖的抑制，PTEN基因表达不断上升。人脐带间充质干细胞可以通过旁分泌的机制对异位子宫内膜细胞的体外增殖产生有效的抑制作用，并促进其凋亡，上调PTEN基因表达^[34]。
综上所述，PTEN基因是子宫内膜异位症发生以及发展过程中的重要基因，人脐带间充质干细胞具有一定的生物活性，可以通过上调PTEN基因的表达，抑制异位子宫内膜细胞增殖，并促进其凋亡。另外，受到研究时间以及实际条件等的限制，本实验相应的结果和结论可能存在一定的不足之处，还有待在今后的研究中予以探讨。