CD133+卵巢癌干细胞样细胞在血管内皮细胞中的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：大量研究证实，新生血管形成在肿瘤的生长、浸润以及转移过程中发挥重要作用。
目的：探讨CD133+卵巢癌干细胞样细胞向血管内皮细胞分化的特点。
方法：通过无血清培养方法从卵巢癌A2780细胞株中成功诱导出CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞，在体外接种于铺或不铺Matrigel基质胶的96孔板内，观察不同时间点CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞和人脐静脉内皮细胞形成管腔样结构能力。通过裸鼠皮下移植实验，免疫荧光法观察CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在卵巢癌血管新生中的作用。
结果与结论：CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞和人脐静脉内皮细胞(阳性对照)在未铺 Matrigel基质胶上并不能形成相应的管腔结构，且不表达内皮细胞标志物CD31，在Matrigel基质胶上能够形成相对稳定的管腔结构，CD31表达明显。CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞接种裸鼠皮下成瘤后，可观察到肿瘤组织中有人源性CD31的表达。结果表明CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞能够分化为血管内皮细胞，参与肿瘤血管重建。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 卵巢癌干细胞样细胞, CD133, 血管内皮细胞, 细胞分化

Abstract:

BACKGROUND: Numerous studies have confirmed that neovascularization plays an important role in the growth, invasion and metastasis of tumors.
OBJECTIVE: To investigate the features of CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells differentiating into vascular endothelial cells.
METHODS: CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells were successfully harvested from A2780 ovarian cancer cell lines using serum-free culture method, and incubated in vitro onto 96-well plates with or without Matrigel. Then, we observed the capacity of CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells and human umbilical vein endothelial cells to form tube-like structures at different time points. Through xenograft experiments, the role of CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells in the angiogenesis of ovarian cancer was observed using immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells and human umbilical vein endothelial cells cultured with no Matrigel had no corresponding lumen formation, and could not express CD31. But those cultured with Matrigel had lumen formation and expressed CD31 significantly. After tumor formation, human-derived CD31 expression was observed in the tumors. These findings indicate that CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells can differentiate into vascular endothelial cells, and be involved in tumor revascularization.

Key words: Stem Cells, Ovarian Neoplasms, Endothelial Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

蒋立艳，楼湘莹，王自能，路妍妍，高瑞萍. CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在血管内皮细胞中的分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.012.

Jiang Li-yan, Lou Xiang-ying, Wang Zi-neng, Lu Yan-yan, Gao Rui-ping. CD133⁺ ovarian cancer stem-like cells differentiate into vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.012.

图/表（结果） 2

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引言

卵巢癌发病隐匿，早期缺乏典型临床症状，患者一旦确诊已经是中晚期^[1]。目前，治疗方法多以手术和放化疗为主，但是5年生存期仅为25%^[2]。研究显示：恶性实体肿瘤细胞的生长期可以分为2个时期^[3]，即：非血管化的侵袭转移前期以及血管化的侵袭转移生长期。在侵袭转移前期，肿瘤细胞的生长主要来源于扩散获得的营养，而当肿瘤生长到1.0-2.0 mm²时，扩散获得的营养不能满足肿瘤的营养需要，肿瘤则需要由血管供氧和营养物质^[4]。研究发现，对于未发生侵袭转移的Ⅰ期卵巢癌，肿瘤新生血管密度较高者，其侵袭转移更加容易^[5-6]。因此，从卵巢癌新生血管角度研究是阐明卵巢癌侵袭转移的关键。
传统经典肿瘤新生血管理论认为：肿瘤之所以出现新生血管，其来源主要有肿瘤血管生成和肿瘤血管发生两种方式。在不依赖血管内皮细胞生长的情况下，肿瘤干细胞能够参与肿瘤血管新生，其可以解释为：在采用抗血管药物治疗后肿瘤组织中原本存在的血管将会被损伤，从而丧失血管新生的能力，而肿瘤组中存在的肿瘤干细胞能够分化为血管内皮细胞，从而为肿瘤血管新生提供动力^[7-8]。李青等^[9]研究内皮素1促进CD133⁺肿瘤干细胞血管新生的机制，结果显示在正常条件和缺氧条件下，经内皮素1处理的细胞内血管内皮生长因子表达明显高于对照组(P < 0.05)；BQ123⁺内皮素1组细胞内血管内皮生长因子mRNA量明显低于内皮素1组(P < 0.05)；经内皮素1处理后，细胞从缺氧转到正常条件下，细胞内缺氧诱导因子1α稳定性增强，提示内皮素1通过其受体A介导CD133⁺细胞内血管内皮生长因子表达上调；降低缺氧诱导因子1α被蛋白酶降解速度，稳定缺氧诱导因子1α的表达，从而促进CD133⁺肿瘤干细胞血管新生。Gilead等将卵巢癌多细胞团接种进裸鼠皮下，结果表明卵巢癌细胞团可以休眠，当血管发生时，休眠的卵巢癌细胞将会被激活并加速生长。利用CD133表面标记物分选获得的CD133⁺细胞具有肿瘤干细胞样特性^[10-11]。
本实验主要通过动物实验探讨CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞向血管内皮细胞分化的特点，为研究其分化机制奠定基础。

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点于2013年12月至2014年12月在暨南大学附属第一临床医学院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 6只6-8周龄雌性裸鼠，体质量0.16- 0.40 kg，平均体质量(0.20±0.01) kg，购买于北京鼎鑫生物有限公司，在暨南大学附属第一临床医学院中心实验室适应性喂养3-6 d。
1.3.2 主要细胞、试剂和仪器卵巢癌A2780细胞系以及人脐静脉内皮细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心^[12-13]。定量 PCR试剂盒(日本TAKARA公司)，DMEM细胞培养基(美国Hyclone公司)，CD31人抗体(美国Cell Signaling公司)，CD31引物(上海生工生物工程公司)，细胞培养瓶(中国成都医疗器械厂)，倒置显微镜(北京重光光学仪器厂)，标准胎牛血清(美国Gbico公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞的培养^[14-15] 卵巢癌A2780细胞放于37 ℃水温箱内迅速升温，加入含体积分数为10%胎牛血清以及1%青/链霉素的DMEM培养基，接种于2 mL培养瓶，放置在37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中，每两三天换液1次，取对数生长期细胞，经消化离心后，用含人表皮生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素的无血清DMEM培养基重悬，以20 000/孔的细胞密度接种在6孔板内，进行常规培养^[16-17]。
1.4.2 人脐静脉内皮细胞的培养将人脐静脉内皮细胞用含有体积分数为10%胎牛血清以及1%的青/链霉素的DMEM培养基常规培养，放置在37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中，每两三天传代1次^[18]。
1.4.3 CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞的体外成管能力实验分为4组，即未铺Matrigel胶卵巢癌干细胞样细胞组、Matrigel胶卵巢癌干细胞样细胞组、未铺Matrigel胶人脐静脉内皮细胞组以及Matrigel 胶人脐静脉内皮细胞组。Martrigel 基质胶放于4 ℃过夜溶解，第2天在冰盒上按照每孔50 μL对96孔板进行铺胶，37 ℃下保温20 min。用预冷枪头在Martrigel基质胶上接种15 000-20 000个细胞，放于37 ℃下培养，分别于2，6，12，24 h镜下观察各组细胞成管情况[19-20]。
1.4.4 免疫荧光法检测内皮细胞CD31表达卵巢癌干细胞样细胞在没有铺胶以及铺胶2种情况下，在37 ℃，体积分数为5%CO₂的孵育箱内培养6 h，然后经40 g/L多聚甲醛和1%戊二醛进行固定，封闭，加入CD31抗体孵育过夜，加入二抗避光孵育30 min，DAPI染核，封固后采用激光扫描共聚焦显微镜观察^[21-25]。
1.4.5 CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在裸鼠体内向内皮细胞的分化取6只6-8周龄裸鼠，在皮下接种10⁵个CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞，注射5周后取出肿瘤，在冰冻恒温机上取8 μm切片，经40 g/L多聚甲醛固定，封闭，加入抗人CD31抗体孵育过夜，加入二抗避光孵育30 min，DAPI染核，封固后采用激光扫描共聚焦显微镜观察^[26-27]。
1.5 主要观察指标 ①CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在Matrigel基质胶上的成管能力。②CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在基质胶上培养表达内皮细胞标记物CD31。③CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在裸鼠体内向内皮细胞的分化情况。
1.6 统计学分析对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，其中符合正态分布的数据进行单因素方差分析，存在统计学意义予以LSD法两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

卵巢癌是临床上常见的疾病，该疾病发病率较高，属于女性生殖系统中高发的恶性肿瘤。由于卵巢癌发病早期症状不显著，多数患者确诊已经是中、晚期，错过了最佳治疗时机^[28]。研究结果显示：肿瘤出现任何数量肿瘤细胞的增加均伴有新生毛细血管的形成^[29]。新生血管能够通过灌注等形式为肿瘤细胞生长提供所需要的营养供给；同时，它也是肿瘤细胞代谢产物排泄的主要途径之一。肿瘤在生长过程中如果缺乏血管为其输送营养，将会影响其生长，它们只能依靠简单的物理弥散^[30-31]。研究发现，对于未发生侵袭转移的卵巢癌而言，肿瘤新生血管密度分布高者，其更加容易发生侵袭和转移。因此，从卵巢癌新生血管角度研究卵巢癌侵袭机制具有重要的意义。
在肿瘤患者体内，存在着一群与胚胎干细胞功能相类似的生物学特性细胞，它们具有自我更新、无限增殖以及多向分化潜能等参与肿瘤的发生、转移和复发等。有研究表明，肿瘤干细胞具有向血管内皮细胞分化的潜能，它是肿瘤血管形成的重要机制之一^[32-33]。本研究成功诱导、分离并鉴别出CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞，其同样具备肿瘤干细胞样生物学特性。CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞和人脐静脉内皮细胞(阳性对照)在未铺Matrigel基质胶上并没有形成管腔结构，但是在Matrigel基质胶上开始逐渐形成和人脐静脉内皮细胞相类似的管腔结构，出现这种现象的原因是多方面的，其可能是CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞分化成血管内皮细胞从而形成管腔结构^[34-35]。免疫荧光结果显示，CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在未铺设Matrigel基胶上不表达内皮细胞标志物CD31；在Matrigel基胶上成管后，内皮细胞标志物CD31表达比较明显，由此说明：CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞血管形成的原因是由于其分化成血管内皮细胞，这个结果和相关研究成果相仿^[36-37]。实验结果显示：CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞在体内环境中同样具有向血管内皮细胞分化的能力^[38-39]。以上结果说明在卵巢癌组织中存在着一类具有干细胞特性，能够向血管内皮细胞分化的肿瘤细胞^[40]。
目前，对于上述现象的具体分子机制并不完全知晓，有研究表明，在缺氧条件下能够有效促进肿瘤干细胞分泌血管内皮生长因子，而血管内皮生长因子又是维持肿瘤干细胞向内皮细胞分化的因素之一，因此在缺氧条件下能够进一步促进肿瘤干细胞向内皮细胞分化^[41]。在不依赖于血管内皮细胞情况下，肿瘤干细胞能够积极参与肿瘤血管新生，这种现象可以解释患者在使用抗血管药物的临床疗效不佳，甚至出现疗效上的“反弹”。当患者服用抗血管药物治疗后，肿瘤组织中原本存在的血管将会被损伤，导致短时间内存在血管新生功能丧失。在卵巢癌组织中也存在肿瘤干细胞，利用CD133表面标记物能够分选获得CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞，从而具有肿瘤干细胞样特性，然而对于CD133⁺卵巢癌干细胞样细胞能否分化为血管内皮细胞研究报道较少，需要进一步研究和分析。
综上所述，CD133+卵巢癌干细胞样细胞具有与普通干细胞类似的功能，能够进行自我更新能，并分化为血管内皮细胞，参与肿瘤血管重建，能够为临床抗血管新生提供依据。