胎儿脐血间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：胎儿脐血间充质干细胞对病变心肌有修复和再生能力，胎儿脐血间充质干细胞移植是治疗心肌梗死的一种新途径。
目的：探讨胎儿脐血间充质干细胞移植治疗大鼠心肌梗死的效果。
方法：选取32只大鼠结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死动物模型，随机等分为移植组和梗死组，从胎儿脐血中分离培养脐血间充质干细胞，制备脐血间充质干细胞悬液，对移植组大鼠进行脐血间充质干细胞移植。
结果与结论：胎儿脐血间充质干细胞在体外可以被成功分离培养；与梗死组相比，移植组大鼠心肌梗死边缘区的微血管密度、左室收缩末压、左室内压最大上升和下降速率显著增加(P < 0.05)，左室舒张末压显著下降(P < 0.05)，心电图情况稍有好转。表明胎儿脐血间充质干细胞治疗心肌梗死大鼠可以促进心肌血管再生，改善心脏功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐血, 间充质干细胞, 心肌梗死, 移植, 心功能

Abstract:

BACKGROUND: Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells are able to repair and regenerate the injured myocardium, which is a new therapy for myocardial infarction via transplantation.
OBJECTIVE: To explore the therapeutic efficacy of intracoronary injection of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells on acute myocardial infarction in rats.
METHODS: Thirty-two rats were selected to make animal models of ligation of the left anterior descending coronary, and then model rats were randomized equally to transplantation group and model group. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were isolated and prepared into cell suspension. Rats in the transplantation group were subjected to transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells were successfully isolated and cultured in vitro. Compared with the model group, the microvessel density, left ventricular end-systolic pressure and ±dp/dtmax were significantly increased in the transplantation group (P < 0.05), while the left ventricular end-diastolic pressure was decreased dramatically (P < 0.05). Electrocardiography findings showed that the heart function of rats in the transplantation group was improved slightly. These findings indicate that human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells can promote myocardial angiogenesis and improve heart function of rats with myocardial infarction.

Key words: Myocardium, Blood Vessels, Cord Blood Stem Cell Transplantation, Coronary Occlusion, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

王巍，李肖甫，李中健. 胎儿脐血间充质干细胞治疗大鼠急性心肌梗死[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.011.

Wang Wei, Li Xiao-fu, Li Zhong-jian. Transplantation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells for treatment of acute myocardial infarction in rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.011.

图/表（结果） 5

2.1 胎儿脐血间充质干细胞的形态胎儿脐血间充质干细胞接种前为圆形(图1A)，原代培养后逐渐贴壁，接种1周时长成短梭形细胞(图1B)，接种1周后由单个核逐渐变为多核，由短梭形变为长梭形，局部片状生长，4周细胞生长达到80%-90%融合(图1C)。第2代胎儿脐血间充质干细胞呈漩涡样生长(图2)，大部分破骨样细胞被去除，细胞形态为成纤维样细胞，14-18 d可以达到融合。

2.2 脐血间充质干细胞的生长情况原代胎儿脐血间充质干细胞逐渐贴壁，接种后2-8 d为潜伏期，无明显扩增情况；10-14 d为对数生长期，细胞生长活跃，3或4周进入平台期，间充质干细胞铺满瓶底，细胞生长逐渐缓慢。胎儿脐血间充质干细胞传代12 h后可见细胞贴壁，每2-4 d增加1倍，5-10 d进入对数生长期，10-14 d细胞铺满瓶底，进入平台期。
2.3 脐血间充质干细胞的免疫表型鉴定流式细胞仪检测结果显示脐血第2代间充质干细胞强表达与间充质细胞相关的表面抗原标志物CD29(88.24%)和CD105(90.04%)，而与造血细胞相关的CD34(0.65%)和CD45(0.39%)极弱表达。
2.4 造模成功动物数量 2组各死亡2只大鼠，梗死组1只造模过程中死亡，1只死于气管插管，移植组1只造模过程中死亡，1只拔管后不能恢复自主呼吸。移植组大鼠移植后均一般情况好，饮食各方面都正常，心梗组大鼠，梗死组大鼠的一般情况较移植组差。
2.5 移植后大鼠血流动力学及心电图变化移植后4周时血流动力学变化由表1可以看出：移植组大鼠左室收缩末压、左室内压最大上升和下降速率较梗死组显著增加，差异有显著性意义(P < 0.05)，左室舒张末压较梗死组显著下降，差异有显著性意义(P < 0.05)。

移植前2组大鼠心电图ST段抬高(图3)，结扎部位心肌变白、心肌运动减弱。心肌梗死后5周，处死大鼠，取出心脏见梗死区表面苍白、室壁薄、纤维化，质地稍韧。苏木精-伊红染色后镜下间：瘢痕部分微血管增生，原心肌细胞核溶解，甚至细胞消失，由胶原纤维代替。移植后4周2组大鼠心电图均未见明显严重心律失常等并发症，移植组心电图示心肌梗死程度较梗死组稍有好转。

2.6 间充质干细胞的移植效果胎儿脐血间充质干细胞移植组大鼠心肌组织中可见移植细胞，主要分布在毛细血管旁、瘢痕周边区(图4)。
2.7 毛细血管密度胎儿脐血间充质干细胞移植组大鼠心肌梗死边缘区的微血管密度为(34.32±3.22)个/200倍视野，显著高于梗死组[(15.4±3.12)个/200倍视野]，差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2015年在郑州大学完成。
1.3 材料健康清洁级雄性SD大鼠32只，鼠龄6-8周龄，体质量280-330 g，购自河南省实验动物中心，动物许可证号：SYXK(豫)2010-0014。实验前饲养1周，饲养于实验室小鼠专用鼠笼，按照实验动物标准进行进食和饮水。实验小鼠符合卫生部一级动物标准，并经过郑州大学动物伦理学委员会批准。
1.4 方法
1.4.1 细胞分离经郑州大学医学伦理学委员会批准并经父母同意后选取足月分娩的健康新生胎儿的脐血50 mL，在无菌条件下，将50 mL新鲜脐血加入肝素摇匀抗凝，加D-Hanks液稀释到100 mL，以2∶1的比例再加入到F-Hypopue离心分层液上，离心30 min，吸取白膜层单个核细胞，将吸取细胞加入D-Hanks，吹打后1 000 r/min离心5 min，弃上清，Friedenstein 法培养^[22]。

1.4.2 原代培养在原代培养基中加入胎牛血清培养液，接种上述分离细胞原代培养液制成的细胞悬液，24 h半量换液，去除非贴壁生长的杂细胞。随后72 h进行一次换液，3次换液后培养基中可有90%左右细胞生长。
1.4.3 消化传代吸出原代培养基中的培养液，经PBS 洗涤后，加入0.5-1.0 mL消化液(含0.25%胰蛋白酶- 0.01%EDTA 0.5-1.0 mL)中消化3 min，吸出消化液静置1.0-2.0 min，加入含血清培养液终止消化，然后按1∶1的比例进行传代接种培养，48 h后进行第1次换液，第1次半量换液，以后每三四天进行1次换液至细胞铺满至瓶底时再重复进行消化传代培养。
1.4.4 细胞鉴定
形态学观察：每天观察培养细胞的形态学变化情况。
生长曲线测定：选取生长良好的原代和传代间充质干细胞，用消化液(含0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA0.5-1.0 mL)消化、PBS洗涤，经过离心后接种于24孔板置培养箱 (37 ℃、饱和湿度含体积分数5% CO₂)中培养。每天取3个孔细胞进行消化离心洗涤，显微镜下计数细胞，取其平均值，观察细胞生长情况。
流式细胞仪检测：将生长良好的第2代间充质干细胞按上述方法制成细胞悬液，予锥虫蓝染色后置于细胞计数板上计数，取100 mL浓度为1×10⁹ L^-1的细胞悬液，分别加入含荧光标记的PE抗人CD29、FITC抗人CD45、PE抗人CD34及FITC抗人CD105抗体，孵育30 min，PBS洗涤，用流式细胞仪检测CD29、CD45、CD34和CD105的表达。
1.4.5 动物梗死模型建立将32只大鼠随机分为梗死组和移植组。2组大鼠戊巴比妥钠麻醉后，固定手术台上，备皮、消毒、剪开皮肤、分离组织肌肉、分离气管，气管插管，连呼吸机。剪开胸部皮肤，分离剪开肌肉，暴漏胸膜，呼气时刺破胸膜，暴露心脏，剪开心包，结扎左前降支及少许心肌组织^[23]。
心电图检测：大鼠心肌梗死模型建立前，将大鼠麻醉成功后固定在手术台上，在四肢皮下按照左上肢黄色、右上肢红色、左下肢绿色和右下肢黑色的链接方式插入电极，电压为2 mV，走纸速度50 mm/s，记录大鼠心电图情况。同样方法记录心肌梗死模型制备后及细胞移植4周后心电图情况。
1.4.6 细胞移植取出干细胞培养基，加入含DAPI的DMEM孵育30 min后，用PBS冲洗，0.25%的胰酶-0.01% EDTA消化液消化使细胞脱壁。将细胞悬液离心、PBS洗涤、重复离心后弃去上清，加入不含血清的DMEM将细胞悬浮为1×10⁸ L^-1备用。
大鼠心肌梗死模型建立后7 d，将移植组大鼠麻醉固定后经尾静脉注入1 mL含DAPI标记的胎儿脐血间充质干细胞悬液。麻醉苏醒后继续饲养，观察每天进食及活动情况。
1.4.7 血流动力学测定心肌梗死模型制备成功后5周，穿刺大鼠右颈动脉，插入与生物医学信号采集处理系统相连的PE50小鞘管，并将小鞘管送入左心室，记录左室收缩末压、舒张末压、左室内压最大上升和下降速率。
1.4.8 免疫组化鉴定取移植组大鼠心肌梗死区组织切片(厚3 mm)，PBS洗后用1∶10正常山羊血清封闭30 min；用1∶1 000小鼠抗大鼠 connexin43单克隆抗体或1∶300兔抗大鼠Troponin-T单克隆抗体4 ℃孵育过夜；PBS洗3次，每次5 min；1∶400羊抗兔IgG-CY3在37 ℃温箱里孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；用体积分数80%甘油PBS进行封固。显微镜下观察拍照。
移植组和梗死组各取4只大鼠的心脏切片，用PBS洗涤后在37 ℃用正常山羊血清(1∶10)封闭30 min；Ⅷ因子多克隆抗体(1∶50)4 ℃过夜孵育；PBS洗涤3次，每次5 min；37 ℃温箱羊抗兔IgG-CY3(1∶400)孵育60 min；PBS洗3次，每次5 min；用体积分数80%甘油PBS进行封固。显微镜下观察拍照。FactorⅧ阳性表达代表微血管，发出红色荧光的内皮细胞簇或单个内皮细胞均为一个血管计数。每只大鼠取2张切片，每个切片选取5个200倍视野，计算梗死边缘区微血管平均数量，即为微血管面密度。
1.5 结局观察指标移植后大鼠血流动力学及心电图变化以及毛细血管密度情况。
1.6 统计学分析数据使用SPSS 18.0进行处理，率的比较采用χ²检验，计量资料用x±s表示，组间均数比较采用SNK法，取P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

心肌梗死主要为心肌细胞缺血坏死，由于心肌细胞的缺血坏死为不可逆的，所以随着缺血坏死心肌细胞的增加，心肌正常细胞被缺血坏死细胞代替，并逐渐纤维化，纤维化后的缺血坏死细胞被胶原纤维细胞代替，心室出现瘢痕并重构，重构后的心脏逐渐出现失代偿，最终发展为心衰。心肌梗死最早的治疗方法为药物治疗，药物治疗对抑制心肌重构有一定效果，但无法逆转和改善缺血坏死性心脏病发展为心衰的进程；随药物治疗后出现了血管重建技术，血管重建术可以改善缺血坏死心肌的血液供应，挽救没有坏死的心肌细胞，对已经发生坏死的心肌起不到作用。20世纪70年代出现了心脏介入治疗技术，心脏介入治疗技术可以减少血管重建率，减少血管再狭窄的发生，对已发生坏死的心肌细胞起不到作用。
在动物实验研究中，间充质干细胞治疗缺血性心脏病已广泛开展，大量的实验证据表明间充质干细胞移植治疗心肌梗死有促进心肌修复和心肌细胞再生的作用，是安全可靠的。在心肌缺血早期，发生急性炎症反应，心肌组织释放大量炎性因子，间充质干细胞可以分泌炎性因子受体；分泌金属蛋白酶，促进间充质干细胞置入梗死心肌内；释放细胞因子和细胞生长因子，保护受损的心肌细胞。
间充质干细胞有多种来源，其中脐血间充质干细胞是其中一种，来源于胎儿出生后的废弃物脐带，不牵扯伦理道德问题，并且资源丰富，取材方便，作为一种干细胞来源将是非常有潜力的^[24-25]。胎儿脐血间充质干细胞在体外能抑制T细胞增殖，有免疫和修复功能^[26-27]，此功能有可能解决移植导致的排斥反应。有研究表明胎儿脐血间充质干细胞具有和骨髓源性干细胞相似或更低的免疫原性，细胞移植后无免疫排斥反应发生^[28]。因此脐血间充质干细胞有可能替代其他间充质干细胞^[29]。
自从Erices和Romanov^[30-31]分离出脐血间充质干细胞后，大量学者对其进行了细胞移植方面的研究。在治疗心肌退行性疾病方面，大量研究表明胎儿脐血间充质干细胞对心肌细胞有修复和再生作用，可能的机制为：直接分化为心肌细胞^[32]、刺激内源性心肌干细胞生长^[33]、旁分泌作用诱导心肌细胞增长^[34]、刺激心肌细胞循环^[35]、动员瘢痕周边内生祖细胞、诱发移植细胞与定居细胞的融合。
有动物实验表明脐血间充质干细胞移植后1周，梗死后的动物心脏重构和左心室射血功能开始恢复，移植后1个月时心脏功能有所恢复，心电图示心肌梗死程度较移植时稍有好转：左房和左室重构减轻，心脏血管密度增加，梗死面积和梗死后恢复期纤维化面积减少，左心室射血分数增加^[36-38]。国外亦有动物和临床研究证明了脐血间充质干细胞移植到心脏缺血梗死区可以分化为正常心肌细胞，修复梗死心肌，减少坏死心肌面积^[39]。胎儿脐血中有间充质干细胞的存在已被大量研究证实，并且证明了胎儿脐血中不仅含有含有间充质干细胞，而且脐血脐血间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性^[40]。
本实验在体外成功的进行了胎儿脐血间充质干细胞的分离纯化和扩增；此研究结果表明，胎儿脐血中的单个核细胞，在适当的条件下可以生长传代，并能获得形态相似的间充质干细胞；流式细胞仪检测结果发现胎儿脐血间充质干细胞强表达与间充质细胞相关的CD29、CD105等标记物，而造血细胞标志的 CD34、CD45等标记物弱表达，表明脐血间充质干细胞有别于造血细胞，是一群未分化的存在于脐血中非定向干/祖细胞。在治疗心肌梗死方面，脐血间充质干细胞移植后的心肌梗死区毛细血管密度显著高于未进行移植的心梗组，心电图较移植时稍有好转，表明脐血间充质干细胞移植治疗心肌梗死效果是肯定的，脐血间充质干细胞有促进血管生成作用。本研究结果与国外研究结果一致，胎儿脐血间充质干细胞移植治疗心肌梗死是安全有效的，可以促进心肌再生、改善心脏功能、减少梗死面积。
脐血间充质干细胞移植在治疗心肌梗死促进血管生成的机制尚不清楚，间充质干细胞可分化为新生血管内皮细胞参与血管发育已被证实^[41-49]。Khaldi等^[50]研究发现间充质干细胞通过刺激宿主血管新生而促血管生成。Kinnaird等^[51]认为间充质干细胞通过旁分泌作用促进血管生成。由此可见间充质干细胞促血管生成的机制可能为:通过旁分泌生长因子促进血管生长；分化为内皮细胞掺入新生血管中促进血管生长。亦有研究认为其机制可能为间充质干细胞引起内源性心肌干细胞的再生从而促进血管生长^[52-53]。本实验结果倾向于通过脐血间充质干细胞的旁分泌作用发挥促进新生血管生成和抑制心肌凋亡的作用，从而起到改善心肌梗死大鼠心脏功能的作用。本实验存在样本少、随访时间短等不足，需在以后的研究中进一步改进。