胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：5-氟尿嘧啶是一种常用的胃癌化疗药物，但临床治疗过程中较易出现耐药现象，影响治疗效果。研究表明肿瘤干细胞对化疗药敏感性较低，可能是导致化疗耐药的重要原因。
目的：体外环境下分析胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，了解胃癌化疗耐药相关机制。
方法：基于克隆形态的分选策略，从人胃癌AGS细胞系内分离胃癌干细胞克隆，采用免疫细胞化学染色分析不同克隆CD44和胸苷酸合成酶的表达，克隆形成实验评估不同类型克隆的自我更新能力，CCK-8法检测不同浓度5-氟尿嘧啶作用下人胃癌AGS细胞克隆生长抑制率。
结果与结论：人胃癌AGS细胞经低密度接种培养后，可形成32个不同形态的克隆，其中，副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为19%(6/32)、66%(21/32)、16%(5/32)。全克隆高表达CD44和胸苷酸合成酶，接种后可再次形成大量二代克隆；次克隆弱表达CD44和胸苷酸合成酶，接种后形成少量的二代克隆；副克隆不表达或弱表达CD44和胸苷酸合成酶，接种后未形成二代克隆。在不同浓度5-氟尿嘧啶的作用下，次克隆以及人胃癌AGS细胞的生长抑制率均显著高于全克隆(P均 < 0.05)。结果表明，在体外条件下，胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶敏感性较低，推测其可能为临床化疗耐药的重要机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 胃癌, 化疗, 氟尿嘧啶, 耐药性, 敏感性, 胸苷酸合成酶, 克隆

Abstract:

BACKGROUND: 5-Fluorouracil is a common chemotherapy drug for gastric cancer, but it is more likely to develop drug resistance in clinical treatment. Studies have shown that tumor stem cells are lowly sensitive to chemotherapeutic drugs, which may be an important cause of chemotherapy resistance.
OBJECTIVE: To analyze the sensitivity of gastric cancer stem cells to 5-fluorouracil in vitro, and to understand the mechanism of drug resistance associated with gastric cancer.
METHODS: Based on the sorting strategy, human gastric cancer cell clones were isolated from AGS cell lines. CD44 and thymidylate synthetase expression in different clones was detected using immunocytochemistry analysis. Clone formation assay was used to evaluate self-renewal capacity of different clones. Cell counting kit-8 was used to determine the clonal growth inhibition rate of AGS under treatment with different concentrations of 5-fluorouracil.
RESULTS AND CONCLUSION: The AGS cells that were inoculated with low density and cultured could differentiate into 32 forms, including the full clone (16%, 5/32), the second clone (66%, 21/32) and the accessory clone (19%, 6/32). Among them, the full clones highly expressed CD44 and thymidylate synthetase, and could generate a great amount of passage 2 clones after inoculation; the second clones showed a weak expression of CD44 and thymidylate synthetase, and could generate a small number of passage 2 clones after inoculation; the accessory clones showed a weak or no expression of CD44 and thymidylate synthetase, and there was no passage 2 clone after inoculation. Under the effect of different concentrations of 5-fluorouracil, the growth inhibition rates of the secondary clones and AGS cells were both higher than that of the full clones (both P < 0.05). These findings indicate that gastric cancer stem cells have a relatively lower sensitivity to 5-fluorouracil in vitro, which is speculated to be an important mechanism of drug resistance.

Key words: Neoplastic Stem Cells, Tumor Stem Cell Assay, Stomach Neoplasms, Fluorouracil, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

何学彦，张超. 胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.009.

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图/表（结果） 3

2.1 人胃癌AGS细胞系不同克隆CD44和胸苷酸合成酶的表达人胃癌AGS细胞经低密度接种培养后，可形成32个不同形态的克隆，其中，副克隆、次克隆、全克隆所占比例分别为19%(6/32)、66%(21/32)、16%(5/32)。在胸苷酸合成酶表达方面，副克隆仅呈现出微弱表达，次克隆呈弱表达，全克隆则呈现出强阳性表达(图1)；在CD44表达方面，全克隆呈现出强阳性表达，次克隆呈现出弱表达，副克隆呈现出阴性表达(图2)。

2.2 不同人胃癌AGS细胞的克隆自我更新能力首次克隆形成实验后共分离32个不同形态克隆，其中全克隆5个，次克隆21个，副克隆6个。
再次进行第2次克隆形成实验，全克隆接种培养后可形成大量二代克隆，有少部分是次克隆和副克隆；次克隆接种培养后形成少量二代克隆，主要为副克隆；副克隆接种培养后未出现二代克隆。
2.3 不同浓度5-氟尿嘧啶作用下人胃癌AGS细胞克隆生长抑制率在不同浓度5-氟尿嘧啶作用下，次克隆以及人胃癌AGS细胞的生长抑制率均显著高于全克隆(P < 0.05)，见图3。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2014年10月至2015年5月在遵义医学院完成。
1.3 材料人胃癌细胞系AGS细胞由上海皓尘生物科技有限公司提供。
1.4 实验方法
1.4.1 人胃癌细胞系AGS细胞克隆形成实验和形态学分类将人胃癌细胞系AGS细胞用含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂的细胞培养箱中，观察细胞生长情况，取对数生长期细胞用0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化液进行消化，机械吹打之后获得单细胞悬液。细胞计数后低密度接种于底部放有盖玻片的培养皿，每皿500个细胞，静置培养6-10 d形成克隆，并按照克隆边缘是否光滑、细胞的大小以及排列的紧密程度等指标将克隆分为3种类型^[10]，分别为全克隆、副克隆和次克隆。

1.4.2 单个克隆自我更新能力检测克隆形态分类之后标记要分离的目标克隆，然后进行细胞计数，吸去培养皿内的培养基，PBS漂洗2次，将克隆环套在目标克隆处，向克隆环内加入消化液并反复吹打获得单细胞悬液，根据目标克隆数吸取一定体积的细胞悬液接种于6孔板内，每孔50个细胞，再次进行克隆形成实验，检测克隆细胞的自我更新能力。
1.4.3 免疫细胞化学染色检测胸苷酸合成酶和CD44的表达采用Envision二步法染色，取出培养皿内的盖玻片，40 g/L多聚甲醛固定，PBS漂洗后滴加一抗(鼠抗人CD44和胸苷酸合成酶单克隆抗体，稀释度分别为1∶100和 1∶50)，4 ℃孵育过夜，PBS浸洗后滴加Supervision二抗，室温孵育30 min，DAB显色。
1.4.4 5-氟尿嘧啶对不同类型克隆细胞的生长抑制情况对目标克隆培养扩增后将其接种于96孔板，培养12 h后分别加入不同浓度的5-氟尿嘧啶(2.5，5.0，10，20，40，80，160 μmol/L)，每个浓度均设置3个复孔，同时设置不加药的对照组，无细胞的空白组。
作用72 h之后吸去培养基添加CCK8试剂进行孵育，采用酶标仪检测470 nm波长处各孔吸光度值，计算相应的细胞生长抑制率。
1.5 主要观察指标 ①不同克隆CD44和胸苷酸合成酶的表达。②不同克隆类型的自我更新能力。③不同浓度5-氟尿嘧啶作用下人胃癌AGS细胞克隆生长抑制率。
1.6 统计学分析数据均利用SPSS 17.0软件处理，采用χ²检验和单因素方差分析方法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

手术、放疗、化疗是治疗肿瘤的常用方法，但治疗效果却一直难以满足患者的需求。胃癌手术治疗虽能迅速切除大块癌组织，在术后仍有部分患者复发和转移^[11]，且放化疗在杀死肿瘤细胞的同时也会杀死机体正常的细胞，导致患者免疫功能严重下降^[12-13]。
从干细胞角度进行分析，肿瘤干细胞是导致肿瘤复发的根本原因^[14-16]。想要实现肿瘤的真正治愈，需要彻底消灭相应的肿瘤干细胞，而化疗、放疗仅可杀死一部分肿瘤细胞，但却无法杀灭肿瘤干细胞，导致耐药等情况出现^[17-20]，这也是停药之后仍可原位复发的原因^[21-24]。通常情况下，肿瘤干细胞处于静息状态，可以耐受一定强度化疗药物的冲击^[25-28]。还有多数研究证实，肿瘤干细胞具有较强的自我分化以及自我更新能力^[29]。在胃癌干细胞相关耐药性方面，以往也有诸多相关报道。陈浩等^[30]进行人胃癌SGC7901细胞对顺铂耐药相关作用机制研究，其中对照组为胃癌SGC7901细胞，实验组为胃癌顺铂耐药细胞株SGC7901/ DDP，通过Hoechst33342染色和免疫组化检测以及Transwell小室实验发现，两组侧群细胞比例和Nanog表达水平以及细胞侵袭力方面差异均有显著性意义，说明胃癌干细胞和顺铂耐药之间存在密切的联系。
5-氟尿嘧啶是一种常用的化疗药物，但在实际的治疗过程中，经常会出现耐药现象，导致无法获得理想的治疗效果^[31-34]。本实验探讨胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性，以研究临床耐药的相关机制^[35]。目前，对胃癌干细胞表面标志物进行分选过程中，大多采用免疫磁珠或者流式细胞仪分选，相应的操作较为复杂、耗时长，且容易出现污染现象^[36-38]。
本实验选择克隆形态划分的方式进行分选，利用分离特征性全克隆方式，获得高度富集的肿瘤干细胞。实验使用人胃癌细胞系AGS，低密度接种后培养6-8 d，可呈现出不同形态的克隆，其中副克隆6个、次克隆21个、全克隆5个。在胸苷酸合成酶表达方面，副克隆仅呈现出微弱表达，次克隆呈弱表达，全克隆则呈现出强阳性表达；在CD44表达方面，全克隆呈现出强阳性表达，次克隆呈现出弱表达，副克隆呈现出阴性表达。以上结果表明，通过分离全克隆获得了实验所需的胃癌干细胞，为后续实验的顺利进行奠定了良好的基础。
第2次克隆形成实验显示，全克隆接种后可形成大量二代克隆，次克隆细胞形成少量二代克隆，副克隆细胞未出现二代克隆。在不同浓度5-氟尿嘧啶的作用下，次克隆以及人胃癌AGS细胞的生长抑制率均显著高于全克隆(P < 0.05)，结果表明，在体外环境下，胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性较低，具有较强的化疗耐受性，影响到实际的治疗效果^[39-40]。
综上所述，基于肿瘤干细胞学说理论，在体外环境下研究胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性。结果发现，胃癌干细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性较低，耐受性更高，且其具有自我更新能力成为胃癌复发的根源。在临床治疗过程中，可以将胃癌干细胞作为靶细胞，通过一定的方式提高其对化疗药物的敏感性，以减少化疗耐药的出现，提高临床治疗效果。