血小板衍生内皮细胞生长因子转染脂肪间充质干细胞促进移植脂肪血管化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：血小板衍生内皮细胞生长因子在脂肪移植中可促进血运重建。
目的：探索血小板衍生内皮细胞生长因子和脂肪间充质干细胞的双重促进脂肪移植成活率的作用。
方法：①从新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪中获取脂肪间充质干细胞，将第3代脂肪间充质干细胞分为实验组、对照组和空白组。实验组以Lenti-PD-ECGF-EGFP转染脂肪间充质干细胞，对照组以Lenti-EGFP转染脂肪间充质干细胞，空白组脂肪间充质干细胞未转染任何病毒。②取已被Lenti-PD-ECGF转染的脂肪间充质干细胞与DMEM完全培养基混合，然后与脂肪组织混合，作为A组；同样的方法用未转染任何病毒液的脂肪间充质干细胞制备B组，单独应用DMEM完全培养基而没有任何细胞成分的为C组。3组移植物注射于大白兔背部左上(A组)、左下(B组)、右上(C组)部皮下组织中。
结果与结论：①实验组脂肪间充质干细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mRNA与蛋白的表达水平高于对照组和空白组，且细胞增殖速度也比对照组和空白组快。②A组移植物质量及毛细血管数量大于B组和C组。提示血小板衍生内皮细胞生长因子基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达该蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的增殖。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 血小板衍生内皮细胞生长因子, 脂肪间充质干细胞, 脂肪移植, 血管化, 慢病毒, 基因转染, 血运重建

Abstract:

BACKGROUND: Platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) can promote revascularization in fat transplantation.
OBJECTIVE: To explore the dual effects of PD-ECGF and adipose-derived mesenchymal stem cells on the survival rate of fat grafts.
METHODS: (1) Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated from the inguinal subcutaneous fat of New Zealand white rabbits, and then cultured. Passage 3 adipose-derived mesenchymal stem cells were divided into experimental group (Lenti-PD-ECGF-EGFP transfected adipose-derived mesenchymal stem cells), control group (Lenti-EGFP transfected adipose-derived mesenchymal stem cells) and blank group (adipose-derived mesenchymal stem cells with no transfection). (2) Lenti-PD-ECGF-EGFP transfected adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in DMEM complete medium, and then mixed with fat tissues as group A; adipose-derived mesenchymal stem cells with no transfection were cultured in DMEM complete medium and then mixed with fat tissues as group B; DMEM complete medium with no cells served as group C. Then, the grafts in groups A, B, C were respectively injected subcutaneously into the upper left, lower left and upper right parts of the rabbits’ black.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In the experimental group, PD-ECGF mRNA and protein expressions were significantly higher than those in the control and blank groups (P < 0.05), and cell proliferation was also the fastest.
(2) Graft weight and the number of capillaries were greater in group A than groups B and C. These findings indicate that PD-ECGF transfection of adipose-derived mesenchymal stem cells not only can continuously express the PD-ECGF protein, but also can promote the proliferation of adipose-derived mesenchymal stem cells.

Key words: Transfection, Lentivirus Infections, Capillaries, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

伞光，宋佳. 血小板衍生内皮细胞生长因子转染脂肪间充质干细胞促进移植脂肪血管化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.008.

San Guang, Song Jia. Platelet-derived endothelial cell growth factor transfection of adipose-derived mesenchymal stem cells promotes vascularization of fat grafts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.008.

图/表（结果） 8

2.1 脂肪间充质干细胞的形态及鉴定接种24 h后，少数较大的细胞开始贴壁，倒置显微镜下观察可见细胞为大而扁平的单层细胞，有的细胞体细长，似成纤维细胞。48 h后大多数细胞贴壁，并开始逐渐伸展并进行分裂，呈梭形，有粗大突起。5-7 d后，细胞逐渐分裂、融合成单层并成簇分布排列。传代后细胞呈梭形，核仁居中，多数为1个核仁(图1A)，也可为双核仁状态(图1B)，圆形或卵圆形，混杂生长细胞随传代次数的增加，杂质逐渐减少。

免疫组化染色结果显示，第3代脂肪间充质干细胞呈CD44，CD49d阳性，CD45，CD106阴性(图2)。

第3代脂肪间充质干细胞成脂诱导2周后，油红O染色显示胞内出现脂滴(图3)。

2.2 慢病毒转染脂肪间充质干细胞的最佳MOI值慢病毒转染72 h后，荧光倒置显微镜发现当MOI值为100时，细胞形态无明显改变，同时也无明显的细胞病变效应，感染效率和平均荧光强度最好，故将100作为本实验的MOI值(图4)。

2.3 血小板衍生内皮细胞生长因子基因及蛋白的表达 ELISA结果显示，Lenti-PD-ECGF-EGFP慢病毒转染组上清液中血小板衍生内皮细胞生长因子水平明显高于未转染组(P < 0.05)；转染组血小板衍生内皮细胞生长因子分泌曲线呈波浪式，于第7天达到峰值，而后逐渐下降，未转染组血小板衍生内皮细胞生长因子水平波动不大(图5)。

反转录PCR及Western blot结果显示，对照组和空白组细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mRNA及蛋白表达水平接近(P > 0.05)；实验组细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mRNA及蛋白表达水平高于其他2组(P < 0.05；图6)。

2.4 脂肪间充质干细胞的增殖 MTT法结果显示，对照组及空白组的脂肪间充质干细胞生长速度较慢，两组细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05)；实验组脂肪间充质干细胞增殖速度比另2组快(P < 0.05；图7)。

2.5 脂肪移植效果
2.5.1 移植物质量移植180 d后，A，B，C三组移植物的质量分别为(187.53±15.67)，(97.21±14.05)和(39.18± 5.29) mg。3组差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5.2 移植物纤维化及脂肪坏死 A组移植物中的脂肪细胞结构均大部分能够保持完整，形态自然，坏死细胞较少，细胞间隙内仅有轻度的组织纤维化体现；B组脂肪形态相对完整，细胞较A组致密程度稍差，有少许组织纤维化；而C组细胞发现坏死较多，细胞形态被破坏严重，出现空泡的现象，细胞间隙内的组织纤维化现象较A和B组明显增多，单位面积内细胞数量少于A和B组(图8)。
2.5.3 新生毛细血管密度 A、B、C三组移植物内毛细血管数量分别为(42.88±9.54)，(23.49±6.21)和(5.04±0.88)条/20倍视野，3组差异有显著性意义(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2015年在无锡坤如玛丽亚医院完成。
1.3 材料

清洁级纯种新西兰大白兔19只，雌雄不限，兔龄3个月，体质量2.0-2.8 kg，由无锡坤如玛丽亚医院整形中心实验室提供，动物许可证号：SYXK(苏)2015-0004。实验动物操作过程遵循实验动物福利要求并获无锡坤如玛丽亚医院实验动物伦理委员会批准。
1.4 方法
1.4.1 脂肪间充质干细胞的培养及传代取1只新西兰大白兔，麻醉后取一侧腹股沟皮下脂肪垫置于无菌盘中，PBS冲洗，0.25%Ⅰ型胶原酶37 ℃水浴消化30 min。200目滤网过滤，再通过1 200 r/min离心5 min，弃上清。将离心后的细胞沉淀用1 mL的完全培养基(含体积分数10%胎牛血清+1%双抗)再次重悬，将1×10⁶细胞接种于直径为100 mm的无菌细胞培养皿中，以完全培养基进行原代细胞培养。每3 d更换完全培养基1次，待到80%-90%融合后，以1∶3传代。实验使用第3代脂肪间充质干细胞。
1.4.2 脂肪间充质干细胞的鉴定取第3代脂肪间充质干细胞，40 g/L多聚甲醛室温固定；含0.5%Triton X-100的PBS渗透；过氧化氢孵育；胎牛血清封闭；加入1∶300稀释的兔抗人多克隆抗体(CD45，检测造血干/祖细胞及成纤维细胞，CD106，用以排除骨髓间充质干细胞)，4 ℃湿盒中过夜；1∶500稀释的山羊抗兔二抗室温孵育30 min，37 ℃温箱孵育30 min；DAB显色，苏木精复染；封固，光学显微镜下观察。
取第3代脂肪间充质干细胞，使用成脂诱导培养基培养，每3 d换液1次，2周后行油红O染色观察细胞中是否形成脂滴。
1.4.3 慢病毒转染脂肪间充质干细胞的最佳感染复数(Multiplicity of infection，MOI) 取第3代脂肪间充质干细胞以5×10⁵/孔的细胞浓度接种至6孔板中，培养24-48 h，待细胞完全贴壁后，弃上清液。取MOI为50，100，150，200的Lenti-PD-ECGF-EGFP慢病毒液转染脂肪间充质干细胞，确定最佳MOI值，并以此最佳MOI值转染第3代脂肪间充质干细胞。
1.4.4 ELISA检测血小板衍生内皮细胞生长因子水平以最佳MOI值转染脂肪间充质干细胞，于转染后第1，3，5，7，9，11，13天分别取转染组和未转染组上清液，采用ELISA试剂盒检测，根据标准曲线，计算血小板衍生内皮细胞生长因子质量浓度。
1.4.5 细胞分组将脂肪间充质干细胞分为实验组、对照组和空白组。实验组以Lenti-PD-ECGF-EGFP转染脂肪间
充质干细胞，对照组以Lenti-EGFP转染脂肪间充质干细胞，空白组脂肪间充质干细胞未转染任何病毒。病毒的MOI均为100，72 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效果。
1.4.6 反转录PCR检测细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mRNA的表达水平 Trizol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测260和280 nm处的吸光度值，比值在1.8-2.0时可进行后续实验。反转录PCR条件：50 ℃、30 min，94 ℃、2 min，1个循环；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，共计30个循环反应。反应结束后取反应液5 μL直接进行1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统分析各条带吸光度值，实验重复3次。
1.4.7 Western blot检测细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子的表达水平细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白，利用BCA试剂盒检测蛋白浓度；配制5%浓缩胶与8%分离胶，60 V×30 min，150 V×1 h进行聚丙烯酰胺SDS凝胶电泳，取下分离胶洗涤3次放入转膜仪，以100 mA×30 min进行转膜，转膜后孵育一抗(1∶1 500)，4 ℃孵育过夜，洗膜后继续孵育二抗及显影液，室温避光孵育30 min，洗脱液洗涤3次终止显色反应，凝胶成像系统分析膜上目的条带与内参的吸光度值。重复实验3次。
1.4.8 脂肪间充质干细胞的增殖各组第3代脂肪间充质干细胞培养24 h后以胰蛋白酶消化，继续培养24 h待细胞贴壁后加入MTT，4 h后弃上清液，DMSO孵育10 min，用酶标仪测量490 nm处吸光度值，计算细胞生长曲线。
1.4.9 脂肪移植及移植后效果观察取上述新西兰大白兔另一侧腹股沟、肩胛皮下及腹膜后脂肪垫，剪碎置于无菌盘中，PBS冲洗3遍以去除血液和杂质，用200目铜网过滤后将脂肪团块倒入5 mL注射器中，保留0.3 mL备用；取已被Lenti-PD-ECGF的脂肪间充质干细胞(5×10⁶)与0.2 mL DMEM完全培养基混合，然后与0.3 mL脂肪组织混合，作为A组；同样的方法用未转染任何病毒液的脂肪间充质干细胞制备B组，单独应用0.2 mL DMEM完全培养基而没有任何细胞成分的为C组。
另取新西兰大白兔18只，吸入乙醚麻醉后，用16号针头注射器分别将3组移植物注射于大白兔背部左上(A组)、左下(B组)、右上(C组)部皮下组织中并进行标记。
移植脂肪组织质量的变化：移植180 d后，戊巴妥纳麻醉后处死新西兰大白兔，沿移植物外被膜完整分离移植的脂肪组织并称质量记录。
病理学观察：移植物用石蜡包埋制作5 μm切片，进行苏木精-伊红染色，观察各组移植物中脂肪细胞形态及纤维化程度。200倍视野下，计算20个不同视野下毛细血管的密度。
1.5 主要观察指标 ①脂肪间充质干细胞形态及增殖。②血小板衍生内皮细胞生长因子的mRNA及蛋白表达水平。③移植物纤维化及脂肪坏死程度。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件对所得结果进行分析，计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

近来有研究报道，脂肪间充质干细胞还十分易于外源性基因的导入，可作为基因治疗的目的基因承载细胞之一，不管是质粒载体，还是腺病毒载体、逆转录病毒载体以及其他载体，均可携带目的基因转染至脂肪间充质干细胞中，并且在体内能够持久并且高效地表达目的因子而不影响其干细胞本身的特性^[15]。
血小板衍生内皮细胞生长因子作为一种促血管新生的细胞因子，在体内与体外都被证实有促血管新生的作用^[16-17]。由于血小板衍生内皮细胞生长因子具有特异的促血管再生的作用，许多学者考虑用血小板衍生内皮细胞生长因子作为生长因子来治疗某些组织缺血性疾患。也有部分学者试图直接将血小板衍生内皮细胞生长因子应用与缺损部位来促进组织愈合，并显示出了一定的疗效^[18]。但若单纯的在移植部位导入血小板衍生内皮细胞生长因子，因其半衰期很短^[19]。
慢病毒载体属于反转录病毒载体类，具有转染力强、可将目的基因整合到宿主细胞基因序列、能转染分裂和未分裂细胞、持续稳定表达、转染安全性高等特点，使目的基因长期稳定表达，远期能取得更好的效果^[20-21]。因此本实验选择慢病毒载体作为血小板衍生内皮细胞生长因子基因的承载方。
本实验通过慢病毒把目的基因转染到脂肪间充质干细胞内，再移植入动物体内，这样就可避免排斥反应的发生。结果显示，转染慢病毒载体后，脂肪间充质干细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子的mRNA和蛋白水平就已经有了显著表达，可保持在一个体外可检测到的水平之上。当转染慢病毒24 h后，就可发现脂肪间充质干细胞的增殖水平出现飞跃，可以由此推测出慢病毒承载的血小板衍生内皮细胞生长因子基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达该目的蛋白，同时也能促进脂肪间充质干细胞的显著增殖，达到一种双赢的效果。
同时从动物实验来看，180 d后通过分离移植物进行称重以及观察到移植物内新生毛细血管密度，表明脂肪间充质干细胞单独与脂肪颗粒混合进行移植就有增强移植组织新血管再生的能力，具有提高脂肪细胞存活率的能力，这与ELISA法测得未转染的脂肪间充质干细胞能少量分泌血小板衍生内皮细胞生长因子的结果相吻合；与自身脂肪颗粒混合后移植于受体皮下，用血小板衍生内皮细胞生长因子基因转染后对该效果具有增强作用，ELISA检测血小板衍生内皮细胞生长因子水平转染组明显高于未转染组就可以证明这一点。虽然用基因治疗和细胞疗法协同作用仍不能保证全部移植组织的存活，但无疑对于自体脂肪移植技术的研究和进展是迈进了一大步。