miR-302对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：间充质干细胞具有自我更新能力，在一定条件下能够分化为一定谱系的细胞，但很多机制至今未明。
目的：探究miR-302b对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控作用。
方法：miR-302模拟物转染作用于脂肪间充质干细胞进行成骨成脂诱导，对照组转染miR-302阴性对照模拟物miR-NC。采用碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色、油红O染色和萃取实验观察miR-302上调对脂肪间充质干细胞成骨和成脂分化的影响，以及Western blot检测miR-302上调后成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在脂肪间充质干细胞中的表达。
结果与结论：①碱性磷酸酶沉淀物在miR-302过表达细胞中产生的量均明显少于对照组，进一步发现miR-302过表达实验组碱性磷酸酶活性明显低于对照组(P < 0.05)。②miR-302过表达明显抑制了矿物质沉积钙结节的形成，miR-302上调实验组橘红色的钙结节明显少于对照组。③miR-302过表达实验组油红O染色阳性的细胞数明显高于对照组，进一步表明实验组细胞萃取得到的油红O吸光度值明显上升(P < 0.05)。④成骨诱导第6天时成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在miR-302过表达的细胞中都有不同程度的下降。⑤以上结果表明miR-302的上调能够抑制脂肪间充质干细胞的成骨分化，同时促进其向成脂分化。miR-302在间充质干细胞向成脂和成骨分化平衡发挥了双向调控作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 成骨分化, 成脂分化, MicroRNAs, 脂肪间充质干细胞, 碱性磷酸酶, RUNX2

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells have the capacity of self-renewal and differentiation into certain lineage cells under appropriate conditions. But many mechanisms are unknown until now.
OBJECTIVE: To clarify the role of miR-302 in the regulation of osteogenic and adipogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells.
METHODS: Chemically synthesized miR-302 specific mimics were transfected into adipose-derived mesenchymal stem cells as experimental group. miR-NC, miR-302b negative control mimics, was transfected into another cells as control group. By the experiments of alkaline phosphatase staining, alkaline phosphatase activity assay, alizarin red staining, oil red O staining and extraction test, the effect of miR-302 upregulation on the adipogenic and osteogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells was analyzed and compared. Western blot assay was used to detect the expression of Runx2 and alkaline phosphatase after regulation of miR-302.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Overexpression of miR-302 decreased the precipitate and activity of alkaline phosphatase significantly as compared with the control group (P < 0.05). (2) Overexpression of miR-302 inhibited the formation of mineral deposits and calcium nodules, and the number of calcium nodules in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P < 0.05). (3) The number of cells positive for oil red O staining was significantly higher in the experimental group than the control group, which further showed the absorbance values of oil red O staining in the experimental group obtained in the extraction test were significantly increased (P < 0.05). (4) At 6 days of osteogenic induction, the expressions of Runx2 and alkaline phosphatase in the experimental group were decreased to different extents. These findings indicate that overexpression of miR-302 can suppress osteogenesis and accelerate adipocytes generation of adipose-derived mesenchymal stem cells. miR-302 plays a two-way regulatory role to balance the osteogenic and adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cells, MicroRNAs, Cell Differentiation, Adipogenesis, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

魏建峰. miR-302对脂肪间充质干细胞向成脂和成骨分化的调控[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.007.

Wei Jian-feng. miR-302 regulates the osteogenic and adipogenic differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.007.

图/表（结果） 5

2.1 miR-302上调后碱性磷酸酶染色采用成骨分化的早期分子标记物碱性磷酸酶染色比较两组细胞成骨分化的程度，发现染成蓝色的碱性磷酸酶沉淀物在miR-302b过表达细胞中产生的量均明显少于对照组，且颜色更浅(图1A，B)，进一步对各组碱性磷酸酶阳性细胞计数，发现miR-302b过表达实验组碱性磷酸酶阳性细胞占总细胞的30%，而这一比例在对照组中高达83%(P < 0.05，图1C)。

2.2 miR-302上调后碱性磷酸酶活性的改变为了进一步评估miR-302上调对细胞成骨分化的影响，用ELISA法检测成骨诱导后各组细胞的碱性磷酸酶活性，结果显示miR-302上调后碱性磷酸酶的活性与对照组比较下降了40%以上(P < 0.05)，见图2。

2.3 茜素红染色观察反映骨细胞增殖分化和骨组织成骨潜能标志的茜素红染色进一步证实miR-302上调后的过表达明显抑制了矿物质沉积钙结节的形成，miR-302上调实验组橘红色的钙结节明显少于对照组，颜色也较对照组浅(图3)。

2.4 Western blot检测结果免疫印迹结果显示成骨分化诱导第6天时成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在miR-302过表达的细胞中都有不同程度的下降，与对照组相比，蛋白表达水平具有明显差异(图4)。

2.5 两组细胞成脂诱导后油红O染色及萃取分析油红O染色显示在间充质干细胞向成脂诱导分化第8天时，miR-302过表达组油红O染色阳性的细胞数明显高于对照组，实验组细胞胞浆中饱满的橘红色脂滴比对照组更大更多(图5A，B)。油红O萃取定量分析进一步表明实验组细胞萃取得到的油红O吸光度值明显上升(P < 0.05，图5C)。

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引言

材料方法

1.1 设计干细胞体外培养实验。
1.2 时间及地点于2014年1月至2015年4月在徐州医学院脑病生物信息重点实验室完成。
1.3 材料无菌解剖取出体质量为(180±20) g成年雄性SD大鼠腹股沟处脂肪。
1.4 实验方法
1.4.1 脂肪源间充质干细胞分离培养无菌条件下取SD大鼠腹股沟处脂肪，高压灭菌PBS冲洗3次，去除筋膜和血管等其他组织，将分离后的组织剪碎，加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，37 ℃振荡消化30 min，1 000 r/min离心15 min，加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬离心1次。以1×10⁶/cm²密度接种于培养皿中，于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱内进行培养，每两三天更换1次培养基，细胞生长至70%-80%汇合时传代。
1.4.2 实验分组实验分为实验组和对照组，第2代或第3代细胞生长至70%-80%汇合时，实验组用Lipofectamine 2000转染miR-302b，同时对照组用Lipofectamine 2000转染miR-302b阴性对照模拟物miR-NC，后续进行相同的成脂或成骨分化诱导，每次实验两组均设置3个以上的复孔，同样的实验重复3次以上。

1.4.3 miRNAs模拟物及转染 miR-302b经过特殊化学分子修饰保证其稳定性。转染过程：①用Opti-MEM分别稀释适当体积的待转染miRNAs和Lipofectamine 2000。②轻轻混匀后室温放置5 min。③将Lipofectamine 2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNAs稀释液中，轻轻混匀。④miRNAs和Lipofectamine 2000混合液室温孵育20 min。⑤从培养箱取出待转染细胞，吸出培养液，用DPBS洗3遍，吸净洗液后每孔加入1.5 mL Opti-MEM。⑥将孵育好的miRNAs- Lipofectamine 2000复合液缓慢逐滴加入培养皿中，轻摇混匀后放培养箱继续培养。⑦转染24 h后，去除转染工作液，用DPBS洗3遍，更换成骨或成脂诱导液继续培养。
1.4.4 间充质干细胞向成骨和成脂诱导分化及鉴定
成骨诱导分化及鉴定：①取第3代间充质干细胞以2×10⁴/cm²的密度接种于培养板中，贴壁过夜后，观察细胞达70%-80%汇合，更换成骨诱导培养液(高糖DMEM培养基中加入体积分数为10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、0.2 mmol/L抗坏血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸钠)继续培养，每隔2 d半量换液1次。②于诱导后的第6天取样，用Western blot法检测成骨表型标志物的表达变化。③分别于诱导后6 d和12 d时，用碱性磷酸酶染色和茜素红染色鉴定钙化情况和矿化基质的产生。
成脂诱导分化及鉴定：①取第3代间充质干细胞以2×10⁴/cm²的密度接种于培养板中，12 h后将培养基改为脂肪诱导培养基(高糖DMEM培养基中加入体积分数为10%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸和100 mg/L IBMX)，每隔2 d半量换液1次，倒置显微镜下观察脂肪滴的形成。②于诱导后8 d用油红O染色鉴定脂滴的生成情况。③用异丙醇对油红O染色阳性的细胞进行萃取，并测定510 nm处的吸光度值。
1.4.5 碱性磷酸酶染色按照碱性磷酸酶染色试剂盒生产商提供的方法进行：①向成骨诱导的培养板中滴加1号液数滴，室温固定50 s，蒸馏水漂洗2 min。②加2号储备液10 mL，加3号液200 µL，然后加入10 mg 4号粉剂，振摇速溶混匀，用滤纸立即过滤。③滴加工作液数滴，置湿盒内于37 ℃孵育2 h，流水冲洗2 min。④甘油封固，显微镜下观察照相。
1.4.6 碱性磷酸酶活性测定按照碱性磷酸酶活性测定试剂盒提供的步骤，将200 μL的碱性磷酸酶底物加入到 5 μL细胞裂解液中，37 ℃孵育30 min，405 nm处检测吸光度值，计算碱性磷酸酶活性，碱性磷酸酶的活性以细胞裂解液的总蛋白浓度为标准化。终止反应可以在200 μL的碱性磷酸酶底物中加入50 μL 3 mol/L NaOH溶液。
1.4.7 茜素红染色 ①培养皿用PBS冲洗3次，体积分数为95%乙醇固定10 min，去离子水冲洗3次。②0.1%茜素红S(用Tris-HCl配置，pH 8.3)37 ℃孵育30 min，阳性细胞被染成橘红色。③蒸馏水冲洗2次。④甘油封固，显微镜下观察照相。
1.4.8 油红O染色及萃取油红O原液的配制：用异丙醇配成1 g/L，避光可长期保存；工作液的配制：60%的油红O原液加40%去离子水，颠倒混匀，室温静置30 min后过滤，现配现用。①培养皿PBS冲洗2次后，用中性甲醛固定10 min。②蒸馏水冲洗，每孔加适量油红O工作液，室温染色1 h。③蒸馏水冲洗。④甘油封固，镜下观察照相。如萃取油红O，油红O染色后用异丙醇对油红O染色阳性的细胞进行萃取，并测定510 nm波长处的吸光度值。
1.4.9 Western blot检测提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取细胞总蛋白经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白恒压转入硝酸纤维膜上。5%牛奶封闭45 min，一抗4 ℃过夜，0.02 mol/L TBS(pH 7.4，含1% Tween-20)洗膜，10 min×3次，二抗1︰3 000，室温孵育2 h，同上洗膜3次，ECL显色曝光后冲洗胶片。β-actin为内参照，ALP(1︰400)，Runx2(1︰200)。
1.5 主要观察指标 ①成骨成脂分化后碱性磷酸酶染色及活性分析、茜素红染色和油红O染色观察。②诱导分化后运用Western blot技术检测miR-302的上调对成骨分化的影响。
1.6 统计学分析对实验数据采用SPSS 17.0进行统计学分析，以x±s表示，两组比较采用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

人口的老龄化和激素在临床上的广泛应用等因素导致临床上骨质疏松症发病率明显增加，临床脂和骨代谢相关疾病可见骨形成的减少和骨髓脂肪细胞增加同时存在^[10-11]，因此干预脂肪生成和骨生成平衡的调控研究有望成为治疗脂肪和骨代谢失衡相关疾病的有效方案。如今，人们广泛认识到，除了编码蛋白质的基因之外，作为小分子非编码RNA的成员之一，miRNAs在干细胞的转录调控网络中发挥着重要的作用，miR-302与干细胞发育、分化、自我更新、增殖和凋亡等密切相关^[12-14]。迄今为止，很多miRNAs被证实参与了间充质干细胞的成骨和成脂分化调控，例如miR-204、miR-17-5p和miR-106a能够抑制间充质干细胞成骨分化，同时促进其成脂分化^[4-5]，提示这些miRNAs可能是骨相关疾病的致病性因素。但到目前为止，关于促进成骨抑制成脂的成骨保护性miRNAs的研究较少。通过碱性磷酸酶染色和活性分析、茜素红染色和油红O染色及萃取分析观察miR-302上调后对间充质干细胞成骨和成脂分化的影响，同时应用Western blot 免疫印迹技术检测了miR-302上调对成骨分化转录因子Runx2和成骨早期标志物碱性磷酸酶在间充质干细胞中的表达情况，miR-302作为能够负向调控成骨分化的miRNAs分子，精密地调控了间充质干细胞的成骨和成脂分化过程。作者分析产生上述结果的原因一方面可能是miR-302与上述提到了几种miRNAs分子产生了类似的作用，在转录和转录后水平直接靶向作用于成骨和成脂分化过程中起关键作用的分子，使得间充质干细胞在成骨和成脂分化平衡调控中发生了改变。另外，最近有研究表明ERK、MAP和JNK等信号途径也参与了间充质干细胞的成骨和成脂分化^[15-16]，另一方面也可能miR-302在成脂和成骨相关的信号途径中发挥了调控作用，进而再作用于成骨和成脂分化相关分子，如RUNX2和PPARγ等，开启成骨和成脂分化的信号通路，进而产生调控作用。在整个调控过程中，也可能多种因素联合作用，驱动着干细胞向一定的方向分化发育。为了进一步验证miR-302抑制成骨促进成脂的调控机制，下一步将通过靶基因预测软件TargenScan等对miR-302的可能靶基因进行预测，找出与成骨成脂分化相关分子的基因3’ UTR上是否存在miR-302的靶向位点，并通过双荧光素酶等方法加以验证，来探求miR-302抑制成骨促进成脂的调控机制。
miRNAs在临床上的应用越来越展现出很好的前景[^17-19]，本研究有望为骨质疏松症等成脂成骨代谢紊乱相关疾病的治疗提供新的干预靶点和治疗思路。在倾向于发生骨质疏松症等成脂成骨代谢失衡疾病的高危人群中，将miRNAs-302设计成靶向骨组织的药物有望能够有效预防或降低上述疾病的发生率，或对发生骨质疏松症等成脂成骨代谢失衡疾病的患者进行有效性的治疗。