PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：脊髓损伤后脊髓自身的修复和再生能力有限，细胞移植治疗脊髓损伤具有很强的临床应用价值和前景。
目的：探讨PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响，以期为组织工程提供更优良的种子细胞。
方法：采用脂质体法转染PTEN基因特异的siRNA沉默PTEN基因，RT-PCR 检测PTEN基因的表达，通过细胞生长曲线、细胞周期、Transwell实验观察PTEN基因修饰后细胞生物学特性的变化。
结果与结论：PTEN基因在骨髓间充质干细胞中高表达并且siRNA成功干扰了PTEN基因的表达，PTEN基因沉默后的细胞具有更强的存活、增殖、迁移能力，更适合作为组织工程的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨髓间充质干细胞, PTEN基因, RNA干扰, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The self-renew and regeneration capacity of the injured spinal cord is thought to be limited. Accordingly, cell transplantation is one potential strategy for promoting functional recovery after spinal cord injury.
OBJECTIVE: To explore the effects of PTEN silencing on the biological properties of bone marrow mesenchymal stem cells, hoping to offer better seed cells for tissue engineering.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were transfected with specific siRNA-silenced PTEN gene using the liposome method, and then RT-PCR was used to detect the mRNA expression of PTEN. Variation of biological properties of PTEN-transfected cells were detected by the way of MTT assay, cell cycle analysis, and Transwell assay.
RESULTS AND CONCLUSION: PTEN is expressed highly in bone marrow mesenchymal stem cells, which is successfully interfered by siRNA. PTEN-silenced cells have stronger survival, proliferation and migration abilities, which become a kind of better seed cells for tissue engineering.

Key words: headings, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, PTEN Phosphohydrolase, RNA Interference, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

陈毅，陆晓东，刘丹平，屠冠军. PTEN基因沉默对骨髓间充质干细胞生物学特性的影响[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.006.

Chen Yi, Lu Xiao-dong, Liu Dan-ping, Tu Guan-jun. PTEN silencing effects on biological properties of bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.006.

图/表（结果） 7

2.1 骨髓间充质干细胞形态倒置光学显微镜下骨髓间充质干细胞呈贴壁生长，均匀分布，形态呈长梭形或多角
形，可见细胞分裂相(图1A，B)。

2.2 RT-PCR检测PTEN基因的表达如图2所示，RNA干扰组PTEN mRNA表达明显减少，说明基因被有效沉默，正常组和阴性对照组未见基因表达减弱。内参基因在各组表达稳定，可排除样本因素干扰。

2.3 细胞生长曲线通过MTT法描绘细胞的生长曲线来反映细胞的生长情况(图3)。
结果示PTEN基因的沉默能明显促进细胞增殖，RNA干扰组的吸光度值在24，48，72 h明显高于正常组和阴性对照组(P < 0.001)。

2.4 各组骨髓间充质干细胞的细胞周期通过检测细胞周期来反映细胞被动员情况(图4)。结果示PTEN基因沉默后出现G₂高峰，G2期和S期细胞增多。阴性对照组和正常组细胞S与G₂期比例无明显变化。

通过细胞周期统计图，以S期和G₂期占总周期的比例来量化细胞被动员情况(图5)。RNA干扰组的S期和G₂期占总周期的比例明显高于正常组、阴性对照组(P < 0.001)。

2.5 Transwell试验结果通过Transwell试验来反映细胞的迁移、分布能力(图6)。结果显示正常组细胞和阴性对照组细胞迁移、分布能力弱，无法透过Transwell小室的B&D胶，PTEN基因沉默能促进细胞迁移，可见骨髓间充质干细胞穿透B&D胶并迁移到小室壁对侧贴壁生长。

对能穿透B&D胶并迁移到对侧的细胞数量进行统计(图7)，结果显示RNA干扰组的细胞数量明显高于正常组、阴性对照组(P < 0.001)。

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引言

材料方法

1.1 设计前瞻性研究。
1.2 时间及地点实验于2012年1月至2015年3月在中国医科大学实验设备中心和金华市中心医院中心实验室完成。
1.3 材料 SD大鼠骨髓间充质干细胞株(Cyagen公司)；PTEN和GAPDH引物、Trizol、RT-PCR试剂盒(TAKARA公司)；Lipofectamin2000(Invitrogen公司)；MTT(Sigma公司)；二甲基亚砜(武汉博士德)；PI(Biosea公司)；BB6220型三气培养箱、Z323K台式低温高速离心机(HEERMLE公司)；倒置光学显微镜(NIKON公司)；PCR仪、图像分析系统、FACSCalibur型流式细胞仪(B&D公司)；凝胶自动成像及分析系统GDS8000(UVP公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养 SD大鼠骨髓间充质干细胞株以1.0×106/cm2的密度移入培养瓶中，在体积分数为5% CO2和37 ℃的培养箱中孵育。每2 d换液，培养液为含体积分数为10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的高糖DMEM培养基。细胞长满80%时，以2.5 g/L胰酶+ 0.2 g/L EDTA消化，按1︰3或1︰4的比例进行传代。另取一部分细胞作为体外培养研究，经鉴定细胞可向成骨细胞和脂肪细胞分化，表面标记物检测CD34、CD45、CD11b表达阴性，而CD44、CD90表达阳性。
1.4.2 细胞分组将第3代细胞分为3组：①正常组：为空白对照，无任何处理因素。②阴性对照组：用脂质体法(Lipofectamin2000)转染无意义的阴性对照siRNA。③PTEN干扰(RNA干扰)组：用脂质体法转染PTEN基因特异的siRNA。
1.4.3 siRNA的化学合成和脂质体法转染针对PTEN基因的特异siRNA由Qiagen公司负责设计合成，并经公司检测其对骨髓间充质干细胞PTEN基因的沉默效率达到90%以上，沉默有效持续时间为4-10 d，其序列见表1。

按照说明书操作，利用脂质体法(Lipofectamin2000)将PTEN基因的siRNA瞬时转染至事先接种在6孔板的骨髓间充质干细胞中。转染后48 h用RT-PCR检测PTEN mRNA的表达。
1.4.4 RT-PCR检测干扰前后PTEN mRNA表达的变化按试剂盒说明操作，用Trizol提取总RNA，RT-PCR试剂盒检测mRNA，退火温度为55 ℃，内参基因为GAPDH。PTEN的引物序列：上游为5’-CCA ATG GCT AAG TGA AGA CGA CAA-3’，下游为5’-CAT AGC GCC TCT GAC TGG GAA TA-3’；GAPDH的引物序列：上游为5’-GTC TTC ACC ACC ATG GAG AAG GCT G-3’，下游为5’-TGA GGT CCA CCA CCC TGT TGC TGT A-3’。2.5%琼脂糖凝胶电泳，使用GeneFinder显色，扫胶。
1.4.5 MTT法描绘细胞生长曲线取4个96孔板，每板分成3组，分别加入各组细胞，每孔2×10³个细胞，在6，24，48，72 h 4个时间点分别取1个96孔板，加入MTT，二甲基亚砜溶解，酶标仪检测吸光度值，绘制各组细胞的生长曲线。
1.4.6 流式细胞仪检测细胞周期每组细胞各取1瓶，制成细胞浓度1×10⁹ L^-1的单细胞悬液，体积分数为75%乙醇固定，加RnaseA和PI工作液，染色，上机检测。
1.4.7 Transwell试验取1个24孔板，内置3个Transwell小碗，铺B&D稀释胶，晾干，碗内加入200 μL含体积分数
为1%胎牛血清的培养液，内含2×10⁴个细胞，碗外孔内加入500 μL含体积分数为30%胎牛血清的培养液，培养24 h，Giemsa染色，显微镜观察，计数。
1.5 主要观察指标 ①骨髓间充质干细胞形态。②PTEN基因的表达。③各组骨髓间充质干细胞的生长曲线。④各组骨髓间充质干细胞的细胞周期。⑤各组骨髓间充质干细胞的迁移、分布能力。
1.6 统计学分析所有测量数据以x±s表示。采用SPSS v12.0统计软件进行统计学分析。数据的比较采用单因素方差分析检验，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞最早由Friedenstein等发现，由于其具有可分化为间充质组织细胞的能力，故称之为间充质干细胞；又由于其起源于骨髓中的支持结构，故称为基质细胞或基质干细胞^[1]。骨髓间充质干细胞来源丰富，提取方便，容易分离纯化和体外扩增，自体移植克服了伦理学争议和排斥反应问题。骨髓间充质干细胞在特定条件下可分化为多种组织谱系的细胞^[2-4]，为组织工程提供了优良的种子细胞^[5-6]。但是，骨髓间充质干细胞植入体内时同样存在种子细胞面临的问题：移植细胞的数量有限，炎症反应及局部缺血缺氧微环境不利于细胞生长，细胞的迁移和分布不足。
第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是目前发现的第一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因，能有效抑制肿瘤细胞的生长，其分子机制正受到广泛关注^[7-8]。PTEN蛋白是双重特异性的磷酸酶，不仅针对蛋白质底物，而且包括酯类底物，是迄今为止发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN的沉默能促进细胞增殖和更新^[9]。PTEN调节细胞周期的进展是通过抑制细胞周期相关基因来实现的，例如cyclin B1，cyclin B2，cyclin D1和cyclin E1等^[10]。此外，p53和PTEN双重基因敲除的细胞通过表达Myc导致分化抑制和持续的细胞更新^[11-15]。正因为PTEN基因比较新型，沉默后能有效地促进细胞增殖和更新，是一种强而广泛的抑癌基因，且人鼠同源性高，易于进行动物实验，所以本实验首选PTEN基因。
PTEN基因沉默能使细胞增殖能力明显增强，使其具备肿瘤样的增殖和存活能力^[16-17]，但PTEN是一种抑癌基因，长期沉默势必形成肿瘤，所以沉默必须是暂时的。RNA干扰是一种由双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象^[18-20]。本实验通过脂质体法导入PTEN基因特异的siRNA，其沉默效率可达90%以上，可见RNA干扰是一种有效的基因沉默手段。同时，由于siRNA的不稳定性，导入细胞内的siRNA持续10-14 d后，逐渐被细胞降解排除体外，细胞恢复正常，这也是实验设计的关键之一，通过siRNA的短期沉默即达到骨髓间充质干细胞移植时抑制细胞凋亡从而促进细胞存活的目的，同时又避免了肿瘤形成。
细胞生长曲线描绘是通过活细胞对MTT的代谢能力来有效评价细胞的增殖能力。细胞周期检测是通过计算细胞在各个细胞周期中所占的比例的多少来评价细胞的分裂趋势。Transwell试验是通过细胞对B&D的降解和穿越Transwell小孔的能力来反映细胞的迁移和分布能力。
实验通过PTEN基因沉默使骨髓间充质干细胞即具有很强的增殖能力和细胞活力，又具有很强的迁移和分布能力，从而为组织工程学提供更优良的种子细胞。