激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞增殖及定向诱导能力均降低

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来，干细胞治疗股骨头早期骨坏死已经成为一种可选的方法，但干细胞质量影响治疗效果。
目的：评价激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力以及定向诱导分化能力。
方法：20只SD大鼠随机分为对照组和观察组，每组10只，观察组构建激素性股骨头坏死模型，分离培养两组大鼠骨髓间充质干细胞。采用CCK-8法检测第3代骨髓间充质干细胞增殖情况。选择第3代骨髓间充质干细胞进行成骨、成脂定向诱导分化。成骨诱导7，14 d行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，成脂诱导21 d行油红O染色。
结果与结论：培养第1，3，5天观察组细胞吸光度值均低于对照组，差异均无显著性意义(P > 0.05)；但第7天时观察组吸光度值显著低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。观察组碱性磷酸酶活性显著低于对照组(P < 0.05)。与对照组比较，观察组的钙结节和脂滴数量较少。以上结果表明激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力和成骨成脂诱导分化能力均减弱。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 激素性股骨头坏死, 动物模型, 骨髓间充质干细胞, 增殖能力, 诱导分化能力

Abstract:

BACKGROUND: In recent years, stem cell therapy for early osteonecrosis of the femoral head has become an alternative method, but the quality of stem cells is a key to the therapeutic outcomes.
OBJECTIVE: To evaluate the proliferative ability and directional differentiation ability of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of steroid-induced femoral head necrosis.
METHODS: Twenty Sprague-Dawley rats were randomly divided into control and observation groups with ten in each group. An animal model of steroid-induced femoral head necrosis was built in the observation group, and then bone marrow mesenchymal stem cells from rats in both two groups were isolated and cultured. Cell counting kit-8 was used to detect proliferation of passage 3 cells. Bone marrow mesenchymal stem cells at passage 3 were selected in the two groups for osteogenic and adipogenic induction. Alkaline phosphatase staining and alizarin red staining were adopted at 7 and 14 days of osteogenic induction, and oil red O staining as performed at 21 days of adipogenic induction.
RESULTS AND CONCLUSION: The absorbance values of bone marrow mesenchymal stem cells were lower in the observation group than the control group at 1, 3, 5 days of culture, but there was no significant difference between two groups (P > 0.05). Until the 7^th day of culture, the absorbance value and alkaline phosphatase activity in the observation group were significantly lower than that in the control group (P < 0.05). Additionally, there were fewer calcium nodules and lipid droplets in the observation group compared with the control group. These findings suggest that the proliferative ability and directional differentiation ability of autologous bone marrow mesenchymal stem cells from a rat model of steroid-induced femoral head necrosis are both decreased.

Key words: Femur Head Necrosis, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Proliferation, Cell

中图分类号:

R394.2

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Yang Guang-jie, Bu Yi-duo, Zhou Bing-kang, Huang Rong. A decrease in proliferative ability and directional differentiation ability of autologous bone marrow mesenchymal stem cells in a rat model of steroid-induced femoral head necrosis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.41.004.

图/表（结果） 4

2.1 动物数量分析入组20只大鼠进入最终的结果分析，未出现死亡。
2.2 动物大体情况对照组动物均正常饮食，体质量逐渐增加，未出现死亡。在经首次异种血清注射之后，观察组动物即开始出现异常，饲料食用量和体质量均出现下降，毛发失去光泽，精神不振；经第2次异种血清注射之后，上述症状进一步加重；经3次甲基强的松龙肌肉注射之后，上述症状得到显著的改善，饮食情况基本恢复至正常水平，体质量上升。入组动物均未出现感染和皮肤溃烂或者死亡。
2.3 骨髓间充质干细胞培养形态经原代培养4 d后细胞贴壁(图1A)，培养7 d后可见大部分细胞呈长梭形贴壁生长(图1B)。

2.4 标本病理学观察苏木精-伊红染色观察可见，观察组骨小梁排列紊乱、稀疏，有的关节局部出现骨坏死现象，空骨陷窝数量增多，脂肪细胞数量较多，且体积增大。
2.5 两组骨髓间充质干细胞增殖情况培养第1，3，5天观察组细胞吸光度值均低于对照组，但差异均无显著性意义(P > 0.05)；第7天时观察组吸光度值显著低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.6 骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化能力观察组碱性磷酸酶活性显著低于对照组[(20.15±1.54) U/L，(53.82± 4.45) U/L，P < 0.05]。
经茜素红染色可见，与对照组比较，观察组的钙结节数量较少(图3)。成脂诱导21 d之后进行油红O染色可见，与对照组比较，观察组的成脂细胞数量较少(图4)。以上表明观察组成骨成脂诱导能力弱于对照组。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。
1.2 时间及地点实验于2014年3至9月在河南大学第一附属医院实验室完成。
1.3 材料

实验动物：雄性成年SD大鼠20只，体质量180-200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。
1.4 实验方法
1.4.1 动物模型构建将20只SD大鼠随机分为对照组和观察组，每组10只。对照组动物首次给予生理盐水注射液(10 mL/kg)腹腔注射，之后间隔7 d，再次进行等剂量腹腔注射，再间隔14 d，第3次进行生理盐水注射液(40 mL/kg)肌肉注射，连续注射3 d。实验组动物首次给予牛血清 (10 mL/kg)腹腔注射，之后间隔7 d，再次进行等剂量腹腔注射，再间隔14 d，第3次进行甲基强的松龙(40 mL/kg)肌肉注射，连续注射3 d。
1.4.2 病理检查处死动物取出股骨头部分，放入甲醛溶液中固定48 h，然后置于10%乙二胺四乙酸二钠溶液中脱钙处理10-14 d，每3 d换液1次，如果经针刺可以达到穿透的程度，则视为处理成功。于冠状位切开标本，石蜡包埋，常规切片后进行苏木精-伊红染色，置于光学显微镜下观察。
1.4.3 骨髓间充质干细胞培养最后一次肌肉注射14 d之后，处死大鼠，取出双侧股骨和胫骨，显露骨髓腔，用含血清的DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集混悬液，立即利用等量磷酸盐缓冲液洗涤，离心后弃去上清液。重复操作2次，接种于50 mL培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养。培养3 d后换液，去除悬浮细胞，待原代培养细胞生长达到瓶底面积80%-90%时，添加0.25%胰蛋白酶消化2.0-3.0 min，添加含血清的DMEM培养基终止消化，离心，弃去上清液，按照1︰3比例接种传代。采用流式细胞仪检测第3代骨髓间充质干细胞表面抗原表达，表达CD105，CD29，CD44，不表达白细胞抗原CD45及造血系标志物CD34，CD133。
1.4.4 细胞增殖情况检测取第3代骨髓间充质干细胞，常规消化、离心后，调整细胞悬液浓度为1×10⁷ L^-1，接种于96孔板，每孔100 μL，每组5个复孔，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂培养箱中培养，于培养1，3，5，7 d CCK-8法检测各组细胞增殖情况。
1.4.5 细胞成骨和成脂能力检测取第3代骨髓间充质干细胞接种在培养皿中，接种密度为2.0×10⁴/cm²，加入成骨诱导液和成脂诱导液进行定向诱导分化，每2 d换液1次，分别在成骨诱导7，14 d进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色；成脂诱导21 d进行油红O染色。
1.5 主要观察指标骨髓间充质干细胞增殖情况和成骨、成脂分化能力。
1.6 统计学分析所有研究数据均录入SPSS 19.0统计学软件，采用两独立样本资料的t 检验进行比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

激素性股骨头坏死属于非创伤性股骨头坏死，临床治疗难度很大^[6-10]。随着器官移植、骨髓移植等技术的发展以及激素冲击疗法等方法的应用，激素性股骨头坏死发病率越来越高，在股骨头坏死中占重要组成部分^[11-14]。激素性股骨头坏死发病机制尚不十分清楚，一般有脂代谢紊乱学说、血液高黏滞状态学说、骨内高压学说、血管内凝血学说、股骨头局部骨细胞凋亡等，上述各种因素作用下最终导致激素性股骨头坏死^[15-19]。
近年来，随着干细胞技术的不断发展，干细胞疗法成为重要的激素性股骨头坏死治疗方案之一^[20-22]。干细胞移植治疗股骨头坏死具有传统治疗方法无可比拟的优势：首先，安全性高^[23-28]；其次，移植的细胞具有较强的新骨再生能力，可以在较短时间内即长出新生骨，达到重建患者股骨头的目的^[29-33]。陈炳鹏等^[34]实验将家兔髂骨骨髓进行离心浓缩处理之后获得的细胞悬液植入股骨头，术后1个月观察到十分明显的修复效果。Hernigou等^[35]利用相同的方式对髋关节疾病患者进行治疗，经随访也获得良好的效果。Gangji等^[36]通过研究发现，髓芯减压联合骨髓细胞移植可以获得良好的临床效果，显著减少患者接受人工全髋关节置换的概率。Matsuya等^[37]也通过构建激素性股骨头坏死动物模型的方式进行研究发现，股骨骨髓间充质干细胞注入股骨髓腔之后，可以获得良好的效果。但是，在干细胞移植治疗过程中，相应的干细胞质量会对最终的治疗效果产生一定的影响。
以往研究主要针对干细胞移植治疗激素性股骨头坏死之后所产生的一系列改变，包括血液相关指标的变化情况和临床病理学改变以及影像学表现变化情况等。关于治疗过程中骨髓间充质干细胞生物学特性的研究内容相对偏少。而且，受到疾病的影响，自体干细胞的细胞外基质成分及比例还有生物学特性等方面可能会出现一定的变化。本实验建立激素性股骨头坏死动物模型，分离培养骨髓间充质干细胞，了解其生物学特性。CCK-8实验结果显示，培养第1，3，5天观察组细胞吸光度值均低于对照组，但差异均无显著性意义(P > 0.05)；第7天时观察组吸光度值显著低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，可见观察组细胞生长较为缓慢。经碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察可以发现，两组细胞均具备一定的成骨诱导能力，但观察组细胞的成骨诱导能力弱于对照组。经油红O染色观察可以发现，观察组的骨髓间充质干细胞依然具有一定的成脂能力，但受到病理状态的影响，已经出现明显减弱的情况，因此较之对照组成脂能力相对偏弱。通过对上述结果的分析也可以推测，激素因素所引发的股骨头坏死不但会导致各种局部病理现象的出现，还会对自身骨髓间充质干细胞功能产生影响，导致细胞无法及时、正常的进行修复，进而影响到实际的治疗效果^[38-40]。
综上所述，激素性股骨头坏死模型大鼠骨髓间充质干细胞的增殖能力以及定向诱导能力减弱，但仍具备一定的干细胞生物学特性。