微囊化人肾上腺嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中的生长和分泌特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.38.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：微囊化细胞是目前常用的免疫隔离工具，可以解决细胞蛛网膜下腔移植存在的免疫排斥问题，然而微囊化对人嗜铬细胞瘤细胞分泌功能的影响尚不明确。
目的：观察微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中的生长及分泌功能。
方法：取手术切除的人嗜铬细胞瘤组织，采用连续分次胶原酶消化法分离人嗜铬细胞瘤细胞，并用人工脑脊液进行原代细胞培养。用海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微囊包裹原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞，用倒置相差显微镜观察人工脑脊液中的微囊化和非微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞的形态；用CCK-8试剂盒测定人嗜铬细胞瘤细胞的增殖情况；用Elisa试剂盒检测微囊化和非微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞分泌的去甲肾上腺素和甲硫氨酸脑啡肽浓度。
结果与结论：微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞镜下呈悬浮、聚集生长状态，细胞突起观察不明显。与非微囊化组相比，微囊化人嗜铬细胞瘤细胞增殖较快，甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的分泌量较多。但不同病例来源的细胞，甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的分泌量差异较大。提示微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中具有良好的生长和分泌功能，并且不同病例来源的人嗜铬细胞瘤细胞可以相对稳定地分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 材料相容性, 人嗜铬细胞瘤细胞, 原代培养, 人工脑脊液, 微胶囊, 微囊化细胞, 免疫隔离, 甲硫氨酸脑啡肽, 去甲肾上腺素, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Microencapsulated cells are commonly used as a tool to overcome immune rejection after subarachnoid transplantation. However, the effect of microencapsulation on the secretion of human pheochromocytoma cells is unclear.
OBJECTIVE: To observe the growth and secretion of primarily microencapsulated cultured human pheochromocytoma cells in artificial cerebrospinal fluid.
METHODS: The human pheochromocytoma tissues were digested successively to isolate human pheochromocytoma cells that were then cultured in artificial cerebrospinal fluid. Primary cells were covered with alginate-polylysine-alginate microcapsules, and then the cell morphology was observed with inverted phase contrast microscope. Levels of met-enkephalin and norepinephrine in cell culture medium were detected by enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA). We used cell counting kit-8 colorimetric assay to obtain the growth curve of human pheochromocytoma cells in artificial cerebrospinal fluid.
RESULTS AND CONCLUSION: Microcapsulated human pheochromocytoma cells were in suspension and the process outgrowth increased slowly. Compared with non-microcapsulated cells, the proliferation rate of microcapsulated cells increased significantly. ELISA results revealed a significant increase in the levels of met-enkephalin and norepinephrine secreted from the microencapsulated cells compared to the
non-microcapsule group. There was a wide variation in contents of met-enkephalin and norepinephrine from different tumors. These findings indicate that microencapsulated human pheochromocytoma cells can survive well and have good secretion function in artificial cerebrospinal fluid, and human pheochromocytoma cells from different tumor tissues have stable secretory function.

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Key words: PC12 Cells, Enkephalin, Methionine, Norepinephrine

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

细胞移植镇痛是近年来疼痛治疗的一个新方法，是将体外培养的自体或异体细胞移植入蛛网膜下腔，通过类似生物微泵的作用让这些移植细胞持续分泌镇痛物质而缓解疼痛或提高痛阈^[1-3]。目前研究最多和最深入的是嗜铬细胞移植镇痛，有研究者将肾上腺嗜铬细胞分离后进行异种/异体移植均取得良好镇痛效果^[4-6]，证实此方法可减少由伤害性刺激引起的伤害性反应，同时这种抗伤害效应能被酚妥拉明和纳洛酮所逆转，表明儿茶酚胺和阿片肽可能与此抗伤害效应有关^[7-9]。在细胞移植治疗中无论是异种移植或同种异体移植均存在不同程度的免疫排斥反应^[10-12]，而微囊化技术的出现解决了这一问题。目前应用最广泛为海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微囊^[13-20]。动物实验和临床试验已证实海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微囊具有免疫保护作用，并且有助于移植细胞长期地分泌镇痛物质^[21-23]。

但由于人肾上腺嗜铬细胞来源匮乏，而异种移植存在交叉感染的风险和伦理学的争议，因此寻求一种新的、可合成和释放镇痛物质，且来源丰富的细胞用于移植镇痛研究极为必要。既往研究发现嗜铬细胞瘤细胞也可分泌去甲肾上腺素、甲硫氨酸脑啡肽、神经肽、神经生长因子等^[24-26]，这为细胞移植镇痛提供新的细胞来源。大鼠嗜铬细胞瘤细胞(PC12)是从大鼠肾上腺髓质瘤中获得的一个细胞株，保留了某些嗜铬细胞的特性，如可合成和分泌儿茶酚胺，表达某些神经肽等^[27]。作者所在团队前期研究结果表明，传代培养的PC12细胞可合成和分泌脑啡肽和去甲肾上腺素；将微囊化PC12细胞移植入神经源性疼痛模型大鼠蛛网膜下腔，可有效缓解大鼠在冷致痛试验中的痛觉过敏现象；同时，大鼠脑脊液中脑啡肽和去甲肾上腺素水平相应升高，进一步的纳洛酮阻断试验证实其镇痛效果为移植入大鼠体内的PC12细胞合成和分泌的脑啡肽起主要作用；此外，在3个月的观察期中未发现肿瘤形成，证实了其安全性^[28-30]。然而，PC12移植仍存在伦理学争议和病毒感染的危险，从而限制了临床应用。

人嗜铬细胞瘤细胞多来源于良性嗜铬细胞瘤患者手术切除的瘤组织，取材方便，这给研究提供了丰富的细胞来源，同时避免了异种移植所致的交叉感染。目前关于人嗜铬细胞瘤细胞的分子水平和细胞水平的生物学研究大多集中于嗜铬细胞瘤发病机制的研究，倾向于为嗜铬细胞瘤患者的临床治疗提供基础依据^[31-33]。有研究曾对人嗜铬细胞瘤细胞的生长和分泌情况在体外进行长期研究，该研究取材于一名存在明显临床症状的37岁男性患者的肾上腺嗜铬细胞瘤^[34]。在长达300 d的原代培养中，人嗜铬细胞瘤细胞保持其分泌去甲肾上腺素的能力，培养90 d以后其去甲肾上腺素的分泌量逐渐下降。也有研究发现体外培养条件下，不同组织来源的人嗜铬细胞瘤细胞的分泌量差别很大^[35]。同时，国内外关于人嗜铬细胞瘤细胞系或细胞株的研究甚少，国外曾有报道发现人嗜铬细胞瘤细胞系KAT45的形态和分泌功能与PC12相似^[36]，但目前国内尚未见文献报道成熟的人嗜铬细胞瘤细胞系用于细胞研究。目前国内外均已建立成熟的人嗜铬细胞瘤细胞的原代培养方法^[35^，^37-38]，但微囊化人嗜铬细胞瘤细胞在体外培养中的生长和分泌情况如何，尚未见文献报道。实验拟通过研究微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中的生长及分泌水平，为进一步研究细胞移植镇痛提供基础依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 材料人嗜铬细胞瘤组织标本均为中山大学孙逸仙纪念医院2010年6月至2014年6月之间进行手术切除并经病理证实为良性嗜铬细胞瘤的肿瘤组织，取得标本后立即进行消化培养。本实验符合伦理学要求，实验中的嗜铬细胞瘤细胞分别来自5例嗜铬细胞瘤患者，这些患者均存在阵发性高血压或持续性高血压阵发性加重、心悸和大汗等典型的临床症状，符合良性嗜铬细胞瘤的临床表现和病理学诊断^[39-41]。手术前本实验研究者与患者及患者家属签署知情同意书，已获得患者及家属同意。

微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞检测使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
Ⅰ型胶原酶、DNA酶、双抗(青霉素和链霉素)、PBS、红细胞裂解液、锥虫蓝、CCK-8试剂盒、多聚赖氨酸、多聚甲醛、H₂O₂	武汉博士德生物工程有限公司
人工脑脊液	湖州英创生物科技有限公司
胎牛血清	Sigma公司
人去甲肾上腺素Elisa试剂盒、人甲硫氨酸脑啡肽Elisa试剂盒	德国HUMAN公司
微囊发生器	挪威NovaMatrix/FMC公司
酶标仪	赛默飞世尔(上海)仪器有限公司

1.2 人嗜铬细胞瘤细胞的原代培养取手术切除的新鲜的人嗜铬细胞瘤组织，6 h内进行细胞原代培养；将组织剪碎至约1 mm³大小，加入0.1%的Ⅰ型胶原酶和0.18%脱氧核糖核酸酶进行消化处理，置37 ℃水浴中消化20 min。吸取上清液至离心管中，留下组织碎块再加入Ⅰ型胶原酶和脱氧核糖核酸酶继续消化。收集上清液经1 000 r/min离心5 min以分离细胞，弃去上清液，按1∶5的比例向细胞沉淀中加入红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，再次1 000 r/min离心5 min，弃去上层红色清液。收集沉淀部分，加入人工脑脊液(含体积分数15%胎牛血清，青、链霉素各1×10⁵ U/L)悬浮细胞，细胞悬液用300目金属网滤器滤入另一离心管中，锥虫蓝染色证明活细胞达90%以上，调整细胞浓度为4×10⁸ L^-¹。倒置相差显微镜观察细胞形态。
1.3 微囊化人嗜铬细胞瘤细胞的构建人嗜铬细胞瘤细胞原代培养24 h后进行微囊化处理。人嗜铬细胞瘤细胞经0.25%胰蛋白酶消化，PBS洗涤3次，1 000 r/min离心     5 min，以弃去悬浮于上清液中的核碎片及单核细胞，加入培养液重悬。将纯化的人嗜铬细胞瘤细胞 30 mL(细胞浓度为1×10⁸L^-¹)分成2份，一份不予微囊包裹，作为非微囊化组；另一份行微囊包裹，作为微囊化组。参照文献^[42]，用0.85%的氯化钠溶液将海藻酸钠配成1.4%溶液，经孔径1.2，0.8，0.45 μm微孔滤膜依次过滤，除去杂质和细菌；用1.4%海藻酸钠溶液重悬实验组人嗜铬细胞瘤细胞，细胞浓度约1×10⁹ L^-¹；用微囊发生器喷入1.1% CaCl₂溶液制成直径100-200 μm的细胞微囊；再依次用0.05%的多聚赖氨酸溶液和0.12%的海藻酸钠溶液包裹，最后用1 mmol/L的柠檬酸钠溶液(pH 7.4)液化微珠核心，形成海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微囊化细胞用无菌生理盐水冲洗3次后，分为5份，加入培养液置于37 ℃、体积分数5 %CO₂培养箱中培养。
1.4 微囊化和非囊化人嗜铬细胞瘤细胞的生长曲线测定将相同细胞密度的微囊化细胞(微囊化组)和细胞悬液(非微囊化组)各自接种在24孔细胞培养板，每天更换新鲜细胞培养液(人工脑脊液)，在细胞微囊化后的第3，5，7，9，11天，用CCK-8试剂盒分别检测两组人嗜铬细胞瘤细胞的细胞数量。首先需要将微囊化组的细胞从微囊中回收^[43]，将海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微囊化细胞置于1.5%柠檬酸钠溶液中搅拌5-10 min，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入培养液重悬。分别采用1 mL细胞培养液重悬微囊化组回收的细胞和非微囊化组的细胞，等量(90 μL/孔)加入96孔细胞培养板中，并加入CCK-8溶液10 μL/孔(为细胞培养液的10%)，置37 ℃温箱中孵育3.5 h，酶标仪    450 nm波长处测吸光度值，空白孔作空白对照。
1.5 微囊化和非囊化人嗜铬细胞瘤细胞分泌功能的测定将相同细胞密度的微囊化细胞(微囊化组)和细胞悬液(非微囊化组)各自接种在24孔细胞培养板，每天更换新鲜培养液，隔天收集细胞培养液，采用Elisa试剂盒测定培养液中的甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的浓度。分别在第3，5，7，9，11天收集24孔板中的细胞培养液，离心收集上清液，置入加有防腐剂(0.1 g/L硫酸庆大霉素)的冻存管中，   -20 ℃冻存，2周内采用Elisa试剂盒检测甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素。
1.6 主要观察指标人嗜铬细胞瘤细胞的增殖及分泌去甲肾上腺素和甲硫氨酸脑啡肽浓度。

1.7 统计学分析由第一作者采用SPSS 13.0统计软件包进行统计处理。计量资料用x(_)±s表示，两组间比较采用重复测量数据的方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

嗜铬细胞瘤起源于神经外胚层嗜铬组织，是一种发生于肾上腺嗜铬细胞的肿瘤，生长在肾上腺内的嗜铬细胞瘤只有5%是恶性肿瘤，约30%的肾上腺外嗜铬细胞瘤都是恶性的^[44-46]。嗜铬细胞瘤具有与嗜铬细胞相似的分泌特性；除分泌儿茶酚胺外，还分泌脑啡肽、神经生长因子、神经肽等^[18-20^，^44-46]。实验已证实，嗜铬细胞蛛网膜下腔移植的镇痛作用是以分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素为主^[47-49]，且两者的共同释放可协同产生镇痛效果^[50]。但人嗜铬细胞来源有限；人嗜铬细胞瘤细胞可来源于患者手术标本，细胞来源较丰富，可为细胞移植镇痛提供新的细胞来源。本实验嗜铬细胞瘤组织均取自肾上腺内，手术过程中未发现组织浸润及肿瘤细胞扩散，术后随访患者症状明显改善，病理诊断证实为良性嗜铬细胞瘤。参考国外和国内相关人嗜铬细胞瘤细胞原代培养的方法^[35^，^37]，本实验对人嗜铬细胞瘤细胞进行体外培养，动态观察细胞的生长，并比较微囊化和非微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中的生长及分泌功能，为进一步研究细胞移植镇痛提供基础依据。
国内外的研究者已经成功建立人嗜铬细胞瘤细胞在DMEM-F12完全培养液中的原代培养，并证实其在体外培养中具有良好的生长和分泌功能^[33^，³⁵^，^37]。人工脑脊液是依据正常人脑脊液的成分进行配置，相对于普通培养液而言，利用人工脑脊液进行细胞培养，更能体现其在人体内的生长和分泌体征，为以后研究该细胞蛛网膜下腔移植镇痛提供了基础依据。实验首次采用人工脑脊液进行原代细胞培养，观察细胞在其中的生长和分泌情况。实验中使用的脑脊液是以Fishman等^[51]提出的正常腰大池脑脊液成分及含量作为人工脑脊液的依据，用化学试剂经物理、化学方法配制而成，其性质与正常人脑脊液相似。作者观察到，原代培养的人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中的生长及细胞形态与既往文献报道的有相似之处^[35]。随着培养时间的延长，人工脑脊液中人嗜铬细胞瘤细胞的突起生长速度相对缓慢，细胞形态保持相对稳定。而微囊化人嗜铬细胞瘤细胞细胞悬浮于微胶囊液态核心，部分聚集生长。本实验结果表明，非微囊化和微囊化人嗜铬细胞瘤细胞均可以在人工脑脊液中存活并生长。

既往研究显示含有胎牛血清的普通培养液中培养的人嗜铬细胞瘤细胞可长期分泌去甲肾上腺素^[34]。目前，关于人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的功能，尚未有报道。在本实验中，原代细胞培养的第7天，微囊化组和非微囊化组细胞甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素分泌量最大，之后细胞分泌量维持在相对稳定的水平。本实验首次观察到人嗜铬细胞瘤细胞可在人工脑脊液中生长并合成和分泌脑啡肽和去甲肾上腺素；同时微囊化的过程及微囊不影响细胞的生长和分泌功能。同时，研究观察到不同病例来源的人嗜铬细胞瘤细胞细胞甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的分泌量差异较大，这与国外文献报道一致^[34-36]。因此，本实验结果表明，体外培养的不同病例来源的人嗜铬细胞瘤细胞可以在人工脑脊液中保持相对稳定脑啡肽和去甲肾上腺素。
作者观察到在细胞培养的各个时间点，微囊化组的细胞数量和分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的水平较非微囊化组的细胞明显增加，因此，微囊的环境有利于细胞的生长。包裹细胞的微囊膜具有选择通透性，该膜对各种免疫细胞、免疫球蛋白分子和补体蛋白具有良好的隔离作用。细胞微囊化可排除细胞移植中出现的宿主与移植物之间的双向排斥作用，从而使能分泌生物活性物质的细胞在移植后得以存活。既往研究已经证明海藻酸盐-聚赖氨酸-海藻酸盐微胶囊是实现动物细胞体外扩增的理想载体之一^[52-54]，其内部的海藻酸钠凝胶作为细胞的良好生长基质，能够促进多数动物细胞在体外以三维方式快速增殖^[55-56]。微囊的直径在200-250 μm，由天然葡聚糖、凝胶等各种聚合物组成，由这些材料制成的微载体主要参考了细胞的黏附特性，在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质，因而有利于细胞的黏附、铺展和增殖。同时，在制作微胶囊时使用柠檬酸钠溶液液化微珠核心，形成的液化型微囊所提供的特定微环境可能更利于细胞在微囊内选择最佳的生存位点和空间微环境，从而使多数细胞偏向于集中在某些囊壁位置，成团生长^[57]。
甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素是最能反映嗜铬细胞分泌活性和镇痛作用的物质，因此是镇痛研究中最常用的检测指标^[35^，^58-59]。Schultzberg等^[60]最先证实了在肾上腺髓质有脑啡肽的标记，且脑啡肽一般存在于肾上腺嗜铬细胞的颗粒中^[58]。前脑啡肽在肾上腺嗜铬细胞中通过剪切酶得到甲硫氨酸脑啡肽，它们与去甲肾上腺素同时释放。脑啡肽主要在脊髓水平起镇痛作用，作用于μ受体和δ受体^[61-63]，参与中枢和外周镇痛机制，同时通过调节脑或脊髓中单胺类及P物质的释放，产生协同镇痛作用^[64]。Duplan等^[65]的研究发现嗜铬细胞中甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素的释放，使脊髓阿片肽受体和α受体共同激活，可协同产生强有力的镇痛效果，并可明显减轻耐受性和成瘾性的形成。由于脑啡肽是疏水性，不容易穿过血脑屏障，且易被肽酶代谢，故即使静脉给药也难以在脊髓后角达到有效的药物浓度发挥镇痛作用。而反复蛛网膜下腔穿刺给药或置管均有增加中枢感染的危险，细胞移植技术将能合成和分泌活性镇痛物质的细胞移植入蛛网膜下腔，相当于“活的微型药泵”，通过其不断释放活性物质从而达到镇痛作用。本实验结果表明，人嗜铬细胞瘤细胞在人工脑脊液中生长良好，并能持续分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素，且微胶囊的环境有利于人嗜铬细胞瘤细胞的生长及分泌。因此微囊化的人嗜铬细胞瘤细胞可作为蛛网膜下腔移植镇痛的细胞来源。
本实验首次采用人工脑脊液进行人嗜铬细胞瘤细胞的原代培养，并成功建立微囊化人嗜铬细胞瘤细胞，发现微囊化人嗜铬细胞瘤细胞可以在人工脑脊液中生长、增殖以及分泌甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素等镇痛物质。选择甲硫氨酸脑啡肽和去甲肾上腺素分泌水平和比例合适的细胞进行移植镇痛，是需要进一步探讨的问题。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程