过表达吲哚-2，3双加氧酶慢病毒载体的构建

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.022

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (36): 5859-5864.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.022

• 干细胞基础实验 basic experiments of stem cells • 上一篇下一篇

过表达吲哚-2，3双加氧酶慢病毒载体的构建

贺继刚，李洪荣，桂龙升，李永武，严丹

云南省第一人民医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650032

出版日期:2015-09-03 发布日期:2015-09-03
通讯作者: 严丹，医师，云南省第一人民医院心脏大血管外科，云南省昆明市 650032
作者简介:贺继刚，男，1980年生，河北省抚宁县人，汉族，2013年苏州大学毕业，博士，主治医师，主要从事干细胞在终末心脏病中的应用研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81460073)；云南省科技厅-昆明医科大学应用基础研究联合专项(2014FB089)

Constructing a lentiviral vector overexpressing indoleamine 2,3-dioxygenase

He Ji-gang, Li Hong-rong, Gui Long-sheng, Li Yong-wu, Yan Dan

Department of Cardiovascular Disease, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Online:2015-09-03 Published:2015-09-03
Contact: Yan Dan, Physician, Department of Cardiovascular Disease, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:He Ji-gang, M.D., Attending physician, Department of Cardiovascular Disease, First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81460073; Applied Basic Research Project of Yunnan Provincial Science and Technology Department & Kunming Medical University, No. 2014FB089

摘要/Abstract

摘要：

背景：器官移植后的免疫排斥反应或免疫抑制药物严重不良反应使患者得不到有效治疗、治疗效果不佳。基于此背景下，结合最新免疫调节研究结果，试图寻找到一种有效的生物免疫抑制方法。

目的：构建过表达吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)慢病毒载体。

方法：①将已构建成功的IDO基因插入慢病毒包装质粒GV308中，构建GV308- IDO重组慢病毒包装质粒。②用慢病毒包装辅助元件Psi、 cPPT、3FLAG、TetR、IRES、WRPE、TetIIP、Ubiquitin Promoter、SV40 origin及HIV的基本元件 5’LTR 和 3’LTR，共培养法转染80%融合的293T细胞。处有一目的片段，该值与IDO蛋白大小一致。RT-PCR检测可见293T细胞中有IDO基因表达。说明IDO融合基因已经成功重组于慢病毒包装质粒内。

结果与结论：Western blot检测经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳可见在 M处有一目的片段，该值与IDO蛋白大小一致。RT-PCR检测可见293T细胞中有IDO基因表达。说明IDO融合基因已经成功重组于慢病毒包装质粒内。_r48 000

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 培养, 融合基因, 重组慢病毒, IDO, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Immune rejections after organ transplantation or serious adverse reactions due to immunosuppressive drugs show a lack of effective treatments and poor therapeutic outcomes. Therefore, we try to find an effective immune suprresion method in combination of the latest immunomodulatory achievements.

OBJECTIVE: To construct a lentiviral vector overexpressing indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO).

METHODS: (1) The IDO gene that was successfully contructed was inserted into lentiviral packaging plasmids GV308 to construct GV308-IDO lentivirus packaging plasmids. (2) The 293T cells with 80% confluence were co-cultured with 5'LTR and 3'LTR, basic elements of lentiviral packaging auxiliary components, including Psi, cPPT, 3FLAG, TetR, IRES, WRPE, TetIIP, Ubiquitin Promoter, SV40 origin and HIV.

RESULTS AND CONCLUSION: Western blot assay showed that in 10 g/L agarose gel electrophoresis, there was a target fragment at M_r48 000. This value was consistent with the size of IDO protein. RT-PCR results showed visible IDO expression in 293T cells. These findings suggest that IDO fusion gene has been successfully reorganized in the lentiviral packaging plasmids.

Key words: Gene Fusion, Indoleamine-Pyrrole 2,3,-Dioxygenase, Lentivirus Infections

中图分类号:

R394.2

贺继刚，李洪荣，桂龙升，李永武，严丹. 过表达吲哚-2，3双加氧酶慢病毒载体的构建[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(36): 5859-5864.

He Ji-gang, Li Hong-rong, Gui Long-sheng, Li Yong-wu, Yan Dan. Constructing a lentiviral vector overexpressing indoleamine 2,3-dioxygenase [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5859-5864.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计构建过表达IDO慢病毒载体。

1.2 时间及地点实验于2015年1至6月在云南省第一人民医院基础研究所完成。

1.3 材料

1.3.1 质粒和细胞株质粒GV308、融合基因片段IDO等购自上海吉凯基因公司。293T细胞为美国ATCC公司产品。

1.3.2 试剂限制性内切酶购自NEB公司，Plasmid 抽提 Kit购自Promega公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，1 kb DNA ladder Marker 购自Fermentas公司，250 bp DNA ladder Marker购自捷瑞公司，DL250+，100T琼脂糖购自赛百盛公司，GA4-100 In-Fusion^TM PCR Cloning Kit购自Clontech公司，Taq polymerase购自SinoBio公司，dNTP购自Takara公司。

1.4 实验方法

1.4.1 IDO重组慢病毒包装质粒的构建过程见图1。

利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物 5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑选平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

1.4.2 载体酶切根据表1，配制 50 µL酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37 ℃反应3 h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。

1.4.3 目的基因片段的获取引物序列见表2。按表3配制反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应(表4)。

表4 PCR扩增目的基因片段反应条件

Table 4 Reaction conditions of PCR-amplified gene fragment

1 Cycle	30 Cycles			1 Cycle	1 Cycle
98 ℃	98 ℃	55 ℃¹	72 ℃	72 ℃	4 ℃
5 min	10 s	10 s	90 s²	8 min	8

表注：¹退火温度依据引物或基因GC含量而定，退火温度一般设定比引物的Tm低5 ℃。²延伸时间依据PCR产物的长度而定。PrimeStar HS DNA聚合酶延伸时间按1 kb/min计算。

1.4.4 IDO基因片段与质粒GV308连接 PCR鉴定与载体进行交换引物见表5，于冰水浴中配制反应体系见表6。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37 ℃反应30 min，随后置于冰水浴中冷却5 min后立即转化。

表5 采用PCR鉴定与载体进行交换引物

Table 5 Primer exchange through PCR identification and carriers

序号	序列
KL14505-P3	CTG GAA GAC ACC CCA ATC T
UBI-R-2	AGT CCC GTC CTA AAA TGT C

表6 采用PCR鉴定与载体进行交换引物反应体系

Table 6 Reaction system of primer exchange through PCR identification and carriers

反应体系	阳性对照(µL)	自连对照(µL)	实验组(µL)
ddH₂O	2.5	4.5	3.5
5×CE II Buffer	2	2	2
酶切后的载体DNA	2.5	2.5	2.5
纯化后的PCR产物片段	2	0	1
Exnase ^TM II	1	1	1
Total	10	10	10

表注：①加入的线性化载体 DNA 和纯化的 PCR 产物的最适摩尔比为 1︰2。②阳性对照加入的纯化PCR产物为 GAPDH 基因(带有同样的交换臂)

1.4.5 转化将10 µL交换反应产物加入到100 µL感受态细胞(239T细胞)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30 min。42 ℃热激90 s，冰水浴孵育2 min。加入500 µL LB培养基，置于37 ℃摇床振荡培养1 h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16 h。

1.4.6 测序将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃培养 12-16 h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析。

1.4.7 质粒抽提将测序正确的菌液转接于10 mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37 ℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。

1.4.8 慢病毒包装与质量检测实验采用第2代自失活型慢病毒包装系统完成包装过程。病毒包装共涉及3个质粒，分别为携带目的基因或靶点序列的工具载体质粒(GV308载体等)、病毒包装辅助质粒(Helper 1.0)、病毒包装辅助质粒(Helper 2.0)，采用三质粒共转染293T细胞。在转染完成后的48-72 h进行病毒收获(即未纯化的细胞上清液)，根据不同的实验需求，确定采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内外实验需求，而后进一步完成质粒转染与慢病毒收获并行慢病毒浓缩、纯化为下面实验应用。

1.4.9 病毒感染239T细胞培养生长状态良好的目的细胞，病毒感染前1 d将目的细胞分入6孔培养板培养，感染当天按实验设计的组别加入慢病毒颗粒进行目的细胞的感染。

1.4.10 感染后细胞目的基因的表达收集生长状态良好的目的细胞，提取蛋白，采用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达情况。按下列比例配置反应体系(表7)。

表7 采用RT-PCR检测目的基因反应体系

Table 7 Reaction system of target gene detected by RT-PCR

试剂	每管加入量(μL)
SYBR premix ex taq	10.0
上游引物(2.5 μmol/L)	0.5
下游引物(2.5 μmol/L)	0.5
cDNA	1.0
RNase-Free H₂O	8.0

1.5 主要观察指标 ①光镜下293T细胞形态。②转染293T细胞Ido基因和蛋白的表达。

讨论

慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。利用慢病毒载体转染目的基因，以便获得稳定的表达，已经成为用于基因研究及治疗的重要工具。它可将目的基因整合入处于分裂及静止期细胞的基因组内^[1]。应用安全性更强的第3代自我灭活慢病毒治疗严重的混合免疫缺陷及增加嵌合型T细胞受体用于肿瘤的治疗获得了更多的成功^[2-5]。慢病毒载体带有伪性VSV-G，主要用于和广泛表达的LDL受体相互作用^[6]。带有VSV-G的慢病毒拥有很高稳定性，它可以进行分离并且产生很高滴度的病毒颗粒^[7]。VSV-G蛋白可通过信号序列(SS)直接进入内质网。VSV-G带有1个糖基和1个三聚体可使病毒与细胞膜融合。如果VSV-G的蛋白结构发生改变将可能出现无法转染或不稳定的慢病毒^[8]。低转染需要更高的MOI值，已经在造血干细胞、原始T细胞、上皮细胞中得到验证^[4^，^9]。采用基因修饰可以封闭慢病毒某些特殊的抗原连接带，从而增加慢病毒和细胞接触时间并提高慢病毒的摄取率^[10-13]。抗体及抗体片段能够成为病毒和细胞膜间高亲和性连接子而提高慢病毒的感染率。在早前研究中将ScFV的N-末端融合入VSV-G可导致慢病毒被破坏，而使其失去传导能力^[14]。采用来源于链球菌的A蛋白(小型抗体)连接慢病毒表面的ZZ区域，可以使慢病毒再次感染目的细胞^[12]。这种方法在体外被证明是成功的，但由于慢病毒及抗体临床应用条件的修改，需要进一步的临床试验。内皮细胞增长因子受体(EGFR)主要表达于上皮细胞中，而CD30主要在淋巴细胞中表达^[15-18]。高亲和力的抗体(如EGFR、CD30)等都可以极大提高病毒转染率^[19-21]。目前可以通过使用抗体成分融合入VSV-G，从而封闭糖蛋白，提高慢病毒转染效率)，也可通过添加结合域^[11]、抗体连接ZZ域^[12]或纤维蛋白连接域^[13]至VSV-GN-末端，可以使病毒固定于胶原/抗体包被的母体或水凝胶上，再将细胞放入培养，可以使转染效率提高5倍以上^[22]。为了增加慢病毒颗粒选择性可以采用EGFR和CD64的抗体封闭融合了链霉亲和素的gp-64(慢病毒伪体辅助单位)，它使得在polybrene存在下病毒感染肺上皮细胞、肝、卵巢癌细胞的MOI值在0.2-1.2^[23]。据报道通过将外源性信号序列融合到ScFV，拮抗人类MHC-I及VSV-G全长N-末端的表达，结果显示慢病毒颗粒可以和目的细胞连接，从而将慢病毒感染效率提高5倍以上^[14]。而Maetzog等^[24]报道采用合一为体(All-in-One)方法可以诱导基于药物控制的DNA片段长度多态性的慢病毒转染体系。实验过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒。所用慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和 pHelper 2.0载体三质粒组成。GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如 WRE(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。实验利用此病毒感染目的细胞293T细胞，经Westen blot及RT-PCR检测使得目的基因得到表达，为进一步试验奠定了坚实的基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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