SPIO、DAPI双重标记猕猴骨髓间充质干细胞：对细胞活性及增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (36): 5741-5745.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.36.001

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SPIO、DAPI双重标记猕猴骨髓间充质干细胞：对细胞活性及增殖的影响

宋巧巧¹，周慧良²，潘兴华³

1湖北科技学院临床医学院内科教研室，湖北省咸宁市 437100； 2咸宁市中心医院，湖北省咸宁市 437100； 3解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省干细胞工程室验室，云南省昆明市 650032

出版日期:2015-09-03 发布日期:2015-09-03
通讯作者: 潘兴华，博士，教授，解放军昆明总医院干细胞与组织器官工程研究中心，云南省干细胞工程室验室，云南省昆明市 650032
作者简介:宋巧巧，女，1987年生，湖北省咸宁市人，汉族，2013年昆明医科大学毕业，硕士，助教，主要从事干细胞移植治疗糖尿病方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31172170)

SPIO and DAPI double labeled bone marrow mesenchymal stem cells of macaques: effects on cell viability and proliferation

Song Qiao-qiao¹, Zhou Hui-liang², Pan Xing-hua³

1Department of Internal Medicine, School of Clinical Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, Hubei Province, China; 2Xianning Central Hospital, Xianning 437100, Hubei Province, China; 3Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China

Online:2015-09-03 Published:2015-09-03
Contact: Pan Xing-hua, M.D., Professor, Stem Cell Engineering Laboratory of Yunnan Province, Kunming General Hospital of Chengdu Military Command, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Song Qiao-qiao, Master, Assistant teacher, Department of Internal Medicine, School of Clinical Medicine, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31172170

摘要/Abstract

摘要：

背景：传统的细胞移植示踪方法均需要在体外状态下进行组织学切片鉴定和分析，这显然限制了干细胞移植进入临床应用，因此，探索无创的、可多次重复应用的活体示踪方法已成为迫切亟待解决的问题。

目的：观察SPIO和DAPI双标记猕猴骨髓间充质干细胞的效果及对干细胞存活、增殖的影响。

方法：全骨髓贴壁法分离培养猕猴骨髓间充质干细胞，并采用流式细胞术对骨髓间充质干细胞进行鉴定。用SPIO和DAPI双标记骨髓间充质干细胞，通过荧光显微镜观察DAPI标记阳性率，普鲁士蓝染色和透射电镜鉴定SPIO标记阳性率，MTT检测标记细胞的活性、增殖能力。

结果与结论：采用全骨髓贴壁法成功获得高纯度猕猴骨髓间充质干细胞，纯度达95.1%。SPIO和DAPI成功标记骨髓间充质干细胞，标记阳性率达95%-98%，且对干细胞的活性、增殖无影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 细胞标记, 骨髓间充质干细胞, 猕猴, SPIO, DAPI, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Traditional cell transplantation tracer methods require histological analysis and identification in vitro, which limits the clinical application of stem cell transplantation. So it is urgent to establish an in vivo noninvasive and repeatable tracer method.
OBJECTIVE: To observe the effect of SPIO and DAPI double labeling on survival and proliferation of bone marrow mesenchymal stem cells from macaques.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells were derived from bone marrow aspirates of healthy macaques using whole bone marrow adherence method. Then, the cells were identified using flow cytometry detection. Bone marrow mesenchymal stem cells were labeled using SPIO and DAPI. Fluorescent microscope was used to detect DAPI positive rate, and Prussian blue staining and transmission electron microscope were employed to measure SPIO positive rate. MTT assay was used to detect cell viability and proliferation.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells were successfully isolated from healthy macaques using the whole bone marrow adherence method, and the cell purity was up to 95.1%. SPIO and DAPI
were both successful to label the bone marrow mesenchymal stem cells with a positive rate of 95%-98%, but had no influence on cell viability and proliferation.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Magnetite Nanoparticles

中图分类号:

R394.2

宋巧巧，周慧良，潘兴华. SPIO、DAPI双重标记猕猴骨髓间充质干细胞：对细胞活性及增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(36): 5741-5745.

Song Qiao-qiao, Zhou Hui-liang, Pan Xing-hua. SPIO and DAPI double labeled bone marrow mesenchymal stem cells of macaques: effects on cell viability and proliferation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(36): 5741-5745.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的培养和扩增培养四五天后细胞分裂增殖明显，出现形态均一的细胞增殖集落(图1A)，培养至8-12 d，80%以上细胞趋于融合，经胰酶消化后1∶2传代，传代细胞呈典型的成纤维细胞样形态(图1B)，分布均匀，生长5 d后传代。 2.2 流式细胞术检测细胞表面标志物经流式细胞术检测可见贴壁细胞均表达CD29、CD44、CD90、CD105，不表达造血细胞表型CD31、CD34(图2)。由此说明，从骨髓分离培养的贴壁细胞为间充质干细胞。2.3 单纯DAPI标记骨髓间充质干细胞荧光显微镜下， DAPI标记12 h即可见细胞核发明亮蓝色荧光，标记率达98%。随标记时间的延长，荧光亮度和标记率均逐渐降低。DAPI标记12-24 h细胞活性、增殖率未受影响，以12-24 h为最佳标记时间(图3)。

2.4 磁标记骨髓间充质干细胞的鉴定见图4。SPIO标记细胞普鲁士蓝染色可见细胞质内大量蓝色致密颗粒分布(图4B)，骨髓间充质干细胞的磁化标记有效率达95%以上，而未标记的骨髓间充质干细胞普鲁士蓝染色未观察到蓝染颗粒，呈阴性(图4A)。透射电镜显示标记的骨髓间充质干细胞胞质中有高密度的铁粒子密集，细胞质中存在的小囊泡状结构内摄入高密度的铁粒子(图4D)，说明骨髓间充质干细胞成功标记。实验观察12，24，48，72 h时间点细胞的标记情况，其中最佳标记时间是24 h，其他各个时间点的普鲁士蓝染色及透射电镜图片上的形态差别不大。2.5 DAPI和SPIO双标记对骨髓间充质干细胞形态的影响与正常细胞相比，倒置相差显微镜下可见SPIO和DAPI双标记组细胞呈长梭形，呈典型的成纤维细胞样形态，正常融合，有棕黄色SPIO颗粒与细胞结合，其形态未见明显变化(图5)。

2.6 MTT法检测标记骨髓间充质干细胞的增殖活力 MTT法测得1-7 d时单纯100 mg/L DAPI、单纯25 mg/L SPIO 标记及双标记组与未标记组的吸光度值比较差异无显著性意义(P > 0.05)，绘制的生长曲线图亦无明显差异(表1)，表明用DAPI和SPIO双标记骨髓间充质干细胞对其增殖活力无明显影响。

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引言

材料方法

1.1 设计骨髓间充质干细胞的培养及双重标记。

1.2 时间及地点于2012年4月至2013年4月在解放军昆明总医院干细胞与组织工程研究中心完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 5岁龄猕猴12只，体质量6-10 kg，雌雄各半，由昆明医学生物研究所动物中心提供。

1.3.2 实验试剂 SPIO颗粒(美国Sigma公司)，DMEM/F12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(美国Gibco公司)、DAPI(美国Invitrogen公司)。

1.3.3 实验器材 Heal Force CO₂培养箱(上海力申科学仪器有限公司)，倒置相差光学显微镜与倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的培养和扩增参考文献[14-15]采用贴壁培养筛选法获得细胞。5岁龄猕猴用3%戊巴比妥钠 1 mg/kg静脉麻醉后，备皮。在无菌条件下，于髂后上棘处用骨穿针穿刺，用内含1 mL肝素钠生理盐水(1 200 U/mL)的50 mL注射器抽出骨髓15-20 mL，加30 mL生理盐水将骨髓稀释、吹打均匀后，经200目细胞筛过滤，2 500 r/min离心 5 min，弃上清，加入10 mL 0.38%NH₄Cl充分混匀，振荡 10 min后，200 r/min离心4 min×3次，弃上清，细胞计数，将收集的细胞移入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，调整细胞浓度至3×10⁸ L^-¹，接种于 175 cm²培养瓶，置于体积分数为5% CO₂、饱和湿度，37 ℃培养箱。四五天首次换液，以后每隔三四天换液1次，8-12 d细胞生长融合达80%以上时，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2传代后继续培养，倒置相差显微镜动态观察细胞形态。

1.4.2 流式细胞术检测细胞表面标志物待细胞培养至第3代，接近80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，用PBS洗涤2次，每管取约5×10⁵个细胞重悬于100 μL抗体稀释液中，分别加入10 μL FITC标记CD29、CD31、CD34、CD44、CD90抗体，10 μL PE标记CD105抗体，避光染色30 min，再加入500 μL鞘液，流式细胞仪检测分析。

1.4.3 单纯DAPI标记骨髓间充质干细胞取第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，2 000 r/min离心 4 min，弃上清，用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬，制成单细胞悬液，稀释至5×10⁸ L^-¹后，接种于6孔板中，每孔100 μL，待细胞融合至80%，弃培养基，按每毫升培养基中加入100 mg/L DAPI工作液10 μL，即终质量浓度为1 mg/L，培养12，24，48，72 h将DAPI标记的细胞用PBS冲洗6遍，荧光显微镜下观察细胞标记情况，至少计数500个细胞，测定各组骨髓间充质干细胞的标记阳性率。

1.4.4 单纯SPIO标记骨髓间充质干细胞参考文献[16]将铁浓度为1 g/L SPIO和0.06 g/L多聚赖氨酸各取500 μL混合，室温振荡孵育60 min，加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12培养基20 mL，使得SPIO终质量浓度 25 mg/L，多聚赖氨酸终质量浓度为1.5 mg/L，备用。将SPIO工作液加入第3代骨髓间充质干细胞中融合至80%，在37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱中培养，于12，24，48，72 h将SPIO标记细胞用PBS冲洗3次，冲去细胞外游离的铁粒子，40 g/L多聚甲醛固定，10%K₃ Fe(CN)₆+20% HCl的Perl反应液孵育30 min，PBS冲洗3次，中性红复染40 s，以细胞内可见蓝色颗粒计为染色阳性。显微镜下至少计数500个细胞，测定骨髓间充质干细胞的标记阳性率。

1.4.5 DAPI和SPIO双重标记骨髓间充质干细胞按上述方法，猕猴骨髓间充质干细胞中分别加入SPIO溶液和DAPI溶液，在体积分数为5% CO₂、饱和湿度，37 ℃培养箱中培养24 h，荧光显微镜下观察DAPI标记阳性率，普鲁士蓝染色双标记细胞，至少计数500个细胞，测定各组骨髓间充质干细胞的标记阳性率。

1.4.6 透射电镜检测标记骨髓间充质干细胞经 1 000 r/min离心5 min后弃上清液，向细胞沉淀中加入2.5%戊二醛溶液固定30 min，然后用1%锇酸固定30 min，再用0.5%醋酸铀4 ℃染色固定过夜后，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋。超薄切片后，用醋酸铀复染，透射电镜观察。

1.4.7 MTT法检测细胞增殖活性将单纯DAPI、单纯SPIO标记及双标记的骨髓间充质干细胞用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM/F12调整细胞浓度至5×10⁷ L^-¹，200 μL均匀接种于96孔板中，以相同浓度的未标记骨髓间充质干细胞为对照。每取出1板贴壁细胞，每孔加入MTT液(5 g/L)15 μL，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂孵箱中孵育4 h，吸去上清，然后加入200 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，以充分溶解细胞代谢产物。分别于培养1，2，3，4，5，6，7 d时，在自动酶联免疫检测仪上测定490 nm波长下各孔吸光度值。

1.5 主要观察指标猕猴骨髓间充质干细胞纯度，以及SPIO和DAPI双标记骨髓间充质干细胞的标记阳性率。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行统计学处理，数据以x(_)±s表示，组间比较用采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

2011年Trounson等^[17]根据美国国立卫生研究院(NIH)公共数据库的临床试验网站http：//clinical trials.gov对近年干细胞治疗临床试验进行了分析，结果显示，目前已有123项应用间充质干细胞进行的临床研究正在开展，说明间充质干细胞具有广阔的临床应用前景。许多实验表明移植入宿主体内的骨髓间充质干细胞能促进宿主体内缺损功能的修复^[18]。细胞移植传统的示踪和监测活细胞的方法主均需要在体外状态下进行组织学分析和鉴定，难以满足干细胞移植进入临床应用的需求。因此，在干细胞移植过程中若能联合其他几种示踪方法，可以提高示踪效果。近年来，随着分子影像学的发展，SPIO作为MR检查的负性对比剂，已用于多种细胞标记及移植后的活体示踪研究，此方法已经引起人们越来越广泛的兴趣。磁共振具有较高的组织空间分辨率，可以在体外无创性地观察SPIO标记的细胞在体内的迁移、存活、增殖、分化，目前已有较多关于干细胞磁性标记及活体内示踪的研究^[19-20]。SPIO为一种纳米级铁颗粒，能在很低的浓度下引起磁共振信号改变，先在体外用SPIO标记细胞，再将一定数目的标记细胞回输体内，经磁共振扫描捕获信号对比来显像。SPIO经带正电荷的多聚赖氨酸转染修饰后^[21]，可通过静电作用与带负电荷的细胞膜配体结合，然后被细胞内吞入胞质中，从而有效地标记骨髓间充质干细胞。本实验用25 mg/L SPIO联合1.5 mg/L多聚赖氨酸标记骨髓间充质干细胞24 h，对标记细胞行普鲁士蓝染色可见细胞蓝染，电镜检查结果证实胞质小囊泡内含高密度的SPIO颗粒，并计算标记率大于95%，MTT实验证明对细胞活性、增殖均无影响，说明SPIO颗粒进入细胞质中，且该方法是安全、有效的。DAPI是一种可与DNA特异性结合的荧光染料，无明显细胞毒性，可以透过完整的细胞膜，能快速进入活细胞中与DNA结合，DAPI-DNA复合物的激发和发射波长分别为360 nm和460 nm，在紫外光的激发下呈蓝色荧光^[22]。本实验采用SPIO标记骨髓间充质干细胞12 h后，再于SPIO标记的骨髓间充质干细胞中加入终浓度为1 mg/L DAPI共培养12 h，在荧光显微镜下可见DAPI细胞阳性标记率为98%；行普鲁士蓝染色可见双标记的细胞蓝染，电镜可见胞质小囊泡内含高密度的SPIO颗粒，并计算标记率大于95%；同时 MTT实验证明SPIO和DAPI对细胞活性、增殖均无影响，说明采用SPIO和DAPI可以成功的双标记骨髓间充质干细胞。采用此方法标记的细胞治疗各种疾病模型既可以直观简单的在体外状态下进行组织学分析和鉴定，通过荧光显微镜下观察移植DAPI标记细胞的归巢，又可以利用磁共振的高组织空间分辨率，在体外无创性地观察SPIO标记细胞在体内的迁移、存活、增殖、分化，二者相辅相成、相互验证，可能为干细胞移植治疗疾病的研究奠定重要的实验基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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