周期性张应力下人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.33.008

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究发现，周期性张应力在一定时间内可以诱导人牙周膜成纤维细胞增殖。
目的：观察周期性张应力对人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子的影响；明确JNK、p38MAPK、PI3K信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子过程中的作用。
方法：采用多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别给予周期性张应力刺激1，6，12，24 h，并以未加力组为对照组。对加力12 h的细胞分别添加JNK、p38MAPK、PI3K信号通路特异性抑制剂预处理，并与未加抑制剂的细胞作对比。应用ELISA法检测培养细胞分泌到上清液中的结缔组织生长因子蛋白；应用荧光定量PCR技术检测细胞结缔组织生长因子mRNA的表达。
结果与结论：加载周期性张应力组与对照组相比较，1 h人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子开始增强、6 h表达明显增强，12 h达最高峰值、24 h表达开始下降。加入JNK信号通路特异性抑制剂后，人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子出现下降；而加入p38MAPK信号通路和PI3K信号通路的特异性抑制剂后结缔组织生长因子表达未发生明显改变。提示在一定时间范围内，周期性张应力引起结缔组织生长因子mRNA与蛋白水平的表达与时间呈依赖性升高；其后随着时间的延长，结缔组织生长因子的表达则开始下降。周期性张应力通过JNK通路的介导调控人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 成纤维细胞, 周期性张应力, 牙周膜成纤维细胞, 结缔组织生长因子, JNK通路, p38 MAPK通路, PI3K通路

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have found that cyclic tensile stress can induce the proliferation of human periodontal ligament fibroblasts in a certain time.
OBJECTIVE: To observe the effect of cyclic tensile stress on the expression of connective tissue growth factor in human periodontal ligament fibroblasts, and to clarify the role of JNK, p38MAPK, PI3K pathway in the cyclic tensile stress-induced expression of connective tissue growth factor in human periodontal ligament fibroblasts.
METHODS: Human periodontal ligament fibroblasts cultured in vitro were given stimulation of cyclic tensile stress in vitro for 1, 6, 12, 24 hours using multi-channel cell stretch stress loading system (experimental group). Control group was set up and not given any stimulation at the same time. The cells under stress application for 12 hours were given specific inhibitors of JNK, p38MAPK, PI3K respectively at the beginning, and were compared with those with no inhibitors. The concentrations of connective tissue growth factor in the culture supernatant were measured by ELISA. The mRNA expression of connective tissue growth factor in human periodontal ligament fibroblasts was detected by real-time RT-PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the expression of connective tissue growthfactor in human periodontal ligament fibroblasts under cyclic tensile stress began to increase at 1 hour, increased manifestly at 6 hours, reached the peak at 12 hours, and then decreased at 24 hours. The expression of connective tissue growth factor was reduced by the specific inhibitors of JNK, while the specific inhibitors of p38 MAPK, PI3K had not the same effect. In a certain time, the cyclic tensile stress can induce a time-dependent increase in mRNA and protein levels of connective tissue growth factor. Along with the extending of time, the expression of connective tissue growth factor begins to decrease. Cyclic tensile stress can regulate expression of connective tissue growth factor in human periodontal ligament fibroblasts via the JNK pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Periodontal Ligament, Fibroblasts, Connective Tissue Growth Factor

中图分类号:

R318

张月，姜长青，于新娟. 周期性张应力下人牙周膜成纤维细胞结缔组织生长因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(33): 5284-5288.

Zhang Yue, Jiang Chang-qing, Yu Xin-juan. Cyclic tensile stress effects on the expression of connective tissue growth factor in human periodontal ligament fibroblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(33): 5284-5288.

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引言

材料方法

讨论

结缔组织生长因子广泛存在于人类多种组织器官中，多种细胞都可表达并分泌。结缔组织生长因子的生物学作用非常广泛，具有促进细胞增殖、合成胶原、诱导细胞凋亡、介导细胞黏附、刺激细胞迁移、促进血管形成、调节细胞外基质基因的表达、促进软骨增生和骨骼发育等等^[9]。

目前机械刺激和机械应力对结缔组织生长因子表达的影响是研究的热点。Xiao等^[10]发现周期性张应力可以使人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA和蛋白表达增高，并呈时间依赖关系。Yamashiro等^[11]应用原位杂交技术检测正畸牙移动大鼠牙周组织中结缔组织生长因子mRNA的表达时发现，正畸力作用12 h后，结缔组织生长因子mRNA在张力侧和压力侧的成骨细胞和近牙周膜的骨细胞中都有强阳性表达，提示结缔组织生长因子参与了正畸牙周组织改建。

段培佳等^[12]对大鼠正畸牙移动不同时间点张力侧牙周组织中结缔组织生长因子mRNA追踪观察发现，牙周组织中成纤维细胞及成骨细胞的结缔组织生长因子mRNA表达强度较正常对照组明显增加，并具有时间变化特点，提示在机械力作用下结缔组织生长因子参与了张力侧的骨形成。

Sakai等^[13]研究正畸牙移动诱导下结缔组织生长因子表达和大鼠骨细胞凋亡时发现，实验开始后2 h在压力侧骨细胞中观察到结缔组织生长因子的mRNA表达，6 h出现骨细胞凋亡，1 d后空骨陷窝明显增多，而张力侧骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达、凋亡细胞和空骨陷窝数在机械刺激期间内没有明显变化，提示作为机械刺激的应答，结缔组织生长因子的表达和随之而来的骨细胞凋亡在牙移动过程中对触发骨改建起重要作用。

本研究表明正常生理情况下适宜的力在一定的时间内可以促进人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子；但当加力时间超过24 h以后，人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子明显降低，可能是因为过长时间的力学刺激抑制人牙周膜成纤维细胞的增殖活性，引起人牙周膜成纤维细胞凋亡或死亡，从而表达结缔组织生长因子降低。

生长因子、细胞因子受到细胞外各种刺激后与相应受体结合，诱发细胞内一系列级联反应，包括蛋白激酶和磷酸酶活化、受体活化、蛋白分子闻转录因子活化等，促使细胞发生凋亡、分裂或增殖等反应，由此构成细胞信号传导系统。

JNK家族是1990年被发现的MAPK超家族成员之一，属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。迄今为止有许多研究证明了JNK通路参与了结缔组织生长因子的表达调控。El-Shewy等^[14]研究发现1-磷酸-鞘氨醇(sphingosine- 1-phosphate，S1P)以剂量依赖方式刺激肾小球膜细胞表达结缔组织生长因子，在阻断ERK1/2和JNK信号通路后这一作用被显著抑制，说明JNK通路参与了这一过程。 Shi等^[15]发现TGF-1诱导端粒酶永生化人角膜基质成纤维细胞表达结缔组织生长因子，这一作用是由JNK通路介导。有研究发现凝血酶通过PAR-1/JNK/AP-1信号途径诱导大鼠血管平滑肌细胞结缔组织生长因子表达^[16]。溶血磷脂酸诱导成肌细胞表达结缔组织生长因子，此表达需要TGF-受体的激活和JNK信号通路的介导^[17]。本研究发现应用JNK通路特异性阻断剂后，周期性张应力上调人牙周膜成纤维细胞的结缔组织生长因子mRNA和蛋白表达明显被抑制，表明阻断JNK通路后，能够抑制周期性张应力诱导的结缔组织生长因子表达。但是发现阻断JNK通路后结缔组织生长因子的表达并没有完全被抑制，由此推断还有其他信号途径参与了这一过程。p38MAPK信号通路是丝裂素活化蛋白激酶(mitogen- activated protein kinases，MAPK)家族的重要成员。目前也有一些研究证明p38MAPK信号通路参与了结缔组织生长因子的表达调控。杨建波等^[18]认为川芎嗪可能通过p38MAPK途径抑制TGFβ1诱导大鼠肝星状细胞结缔组织生长因子的基因表达。荣琳琳等^[19]发现低氧可以刺激人肾间质成纤维细胞表达结缔组织生长因子蛋白和mRNA，且该作用依赖p38MAPK通路的活化。PI3K即有丝氨酸/苏氨酸激酶的活性也同时具有磷脂酰肌醇激酶的活性，属于一种能使三羧基磷酸化聚合成磷脂酸肌醇磷脂的激酶家族成员。近来有一些研究证明PI3K信号通路参与了结缔组织生长因子的表达调控。Kim等^[20]研究发现神经调节蛋白1(NRG1)诱导肥厚性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达增高，PI3K信号通路参与了这一过程。李彩蓉等^[21]研究发现醛固酮可通过抑制盐皮质激素受体和PI3K信号转导通路诱导大鼠系膜细胞内结缔组织生长因子蛋白的表达。本研究发现应用p38MAPK、PI3K信号途径特异性阻断剂后，周期性张应力上调人牙周膜成纤维细胞的结缔组织生长因子mRNA和蛋白表达没有明显变化，表明周期性张应力诱导人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子不依赖于p38MAPK、PI3K通路。总之，在一定时间范围内，周期性张应力引起结缔组织生长因子mRNA与蛋白水平的表达与时间呈依赖性升高；其后随着时间的延长，结缔组织生长因子的表达则开始下降。周期性张应力通过JNK通路的介导促进了人牙周膜成纤维细胞对结缔组织生长因子的表达，p38MAPK通路、PI3K通路在周期性张应力诱导的人牙周膜成纤维细胞表达结缔组织生长因子中不起作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程