人脂肪干细胞向淋巴管样内皮细胞分化的最佳条件

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：作者所在课题组前期研究表明，脂肪干细胞在血管内皮生长因子C作用下，可以诱导分化为淋巴管样内皮细胞，经淋巴内皮细胞透明质酸受体1染色证实为淋巴管样内皮细胞，但其最佳诱导方案尚不明确。
目的：探讨利用血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C156s)诱导脂肪干细胞成为淋巴管样内皮细胞的最佳条件。
方法：取健康成人脂肪组织，胰酶消化法获得脂肪组织来源的间质干细胞，通过流式细胞仪检测其表面标记，并进行成脂肪、成骨诱导等体外分化能力鉴定。取生长状态良好的第3代细胞，对照组加入低糖DMEM培养基，其余5组分别加入含25，50，100，200，300 μg/L VEGF-C156s，分别观察诱导结果。
结果与结论：成功分离纯化脂肪干细胞，在体外成功利用含VEGF-C156s、碱性成纤维生长因子等生长因子的诱导液将脂肪干细胞诱导为淋巴管内皮样细胞，对照组未见明显淋巴内皮细胞透明质酸受体1染色阳性细胞。诱导8 d后，25 μg/L VEGF-C156s诱导后可见少数细胞染色阳性；50，100 μg/L VEGF-C156s诱导后可见大量细胞淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性表达；200，300 μg/L VEGF-C156s诱导会导致细胞大量死亡。说明以质量浓度为50 μg/L的VEGF-C156s诱导8 d，是脂肪干细胞诱导分化为淋巴管样内皮细胞的最佳条件。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 淋巴管内皮样细胞, 血管内皮细胞生长因子C, 淋巴管内皮细胞透明质酸受体1, 组织工程淋巴管, 诱导, 分化能力

Abstract:

BACKGROUND: Our previous studies have shown that adipose-derived stem cells under vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) can be induced to differentiate into lymphatic endothelial cells that are confirmed by lymphatic vascular endothelial hyaluronan receptor-1 staining. However, its optimal induction program is not clear.
OBJECTIVE: To investigate the best condition for the differentiation of adipose-derived stem cells into lymphatic endothelial cells under induction of VEGF-C156s.
METHODS: Adipose tissues from healthy adults were collected to isolate adipose-derived mesenchymal stem cells using trypsin digestion method. Flow cytometry was employed to detect cell surface markers, and in vitro differentiation capacity was identified by adipogenic and osteogenic induction. Passage 3 cells at good growth state were selected and divided into six groups: cells in control group were cultured in low-glucose DMEM, and those in the rest five groups were treated with 25, 50, 100, 200, 300 μg/L VEGF-C156s, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells were successfully obtained by trypsin digestion and purification, and then differentiated into lymphatic endothelial cells under the induction of VEGF-C156s, basic fibroblast growth factor and other growth factors. No cells were positive for lymphatic vascular endothelial hyaluronan receptor-1 in the control group. After 8 days of induction, few cells were positive in the 25 μg/L VEGF-C156s group; a great amount of positive cells were visible in the 50 and 100 μg/L VEGF-C156s groups; 200 and 300 μg/L VEGF-C156s resulted in a large number of deaths in the cells. These findings indicate that it is optimal for adipose-derived stem cells to differentiate into lymphatic endothelial cells under 8-day induction of 50 μg/L VEGF-C156s.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Endothelial Cells, Lymphatic Vessels, Endothelial Growth Factors, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

陈小虎，陈添和，徐学战，郭强.
人脂肪干细胞向淋巴管样内皮细胞分化的最佳条件[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5177-5181.

Chen Xiao-hu, Chen Tian-he, Xu Xue-zhan, Guo Qiang. Optimal induction conditions for adipose-derived stem cells differentiating into lymphatic endothelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5177-5181.

图/表（结果） 3

2.1 原代培养的脂肪干细胞脂肪干细胞培养4-6 h后，部分细胞开始贴壁，以后逐渐增多；两三天后细胞增殖至80%-100%，呈纺锤状“成纤维细胞样”生长(图1)。 2.2 脂肪干细胞的鉴定结果流式细胞术检测显示原代培养的脂肪干细胞呈示CD13、CD29、CD44、CD105高表达，CD31、CD34、CD45、HLA-DR低表达(图2)，具有间充质干细胞特性，并可以向成脂肪和成骨方向分化(图3)。在成脂肪分化的过程中脂肪干细胞由长梭形逐渐变成类圆形，胞浆中出现大量透亮的小脂滴，并不断融合成为很大的脂滴，经油红O染色可被染成红色，证实胞浆确实中有脂质的沉积；成骨诱导过程中出现钙沉积。2.3 不同浓度的VEGF-C156s诱导脂肪干细胞向淋巴管样内皮细胞分化的效果对照组及25 μg/L VEGF-C156s组脂肪干细胞未见明显的形态变化；50，100 μg/L VEGF-C156s组“成纤维细胞样”逐渐缩短，其形态多呈椭圆形或多边形，可伸出伪足，呈有规则的集束辐射状排列，细胞数量逐渐增多，第8天后形态保持相对稳定，无明显继续变化；200，300 μg/L VEGF-C156s组初始可见细胞大量增殖，形态和中浓度组基本相同，第4天开始可见300 μg/L VEGF-C156s组细胞大量死亡，第5天开始可见200 μg/L VEGF-C156s组细胞大量死亡，提示高浓度VEGF-c156s可能具有较大的细胞毒性。

免疫荧光染色可见，干预8 d后，对照组未见淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性细胞；25 μg/L VEGF-C156s组中可见少量淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性细胞；50，100 μg/L VEGF-C156s组可见大量淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性细胞，且50，100 μg/L VEGF-C156s组中，淋巴内皮细胞透明质酸受体1荧光强度接近，且远高于对照组及0，25 μg/L VEGF-C156s组(P < 0.01；图4，5)。因此认为诱导淋巴管样内皮细胞的最佳环境是50 μg/L VEGF-c156s诱导8 d。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2014年6月至2015年1月在中山大学和中山大学附属第一医院完成。

材料：

脂肪干细胞诱导分化使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
低糖DMEM培养基，胰蛋白酶	Hyclone 公司
胎牛血清	Sigma公司
人重组VEGF-C156s，羊抗人淋巴内皮细胞透明质酸受体1抗体	R&D公司
FITC标记的二抗	北京中衫公司
人重组碱性成纤维生长因子	Peprotech公司
倒置相差显微镜，荧光显微镜	Olympus公司
流式细胞仪	美国Beckman Coulter公司

健康成人脂肪组织取自3例成年女性抽脂患者，所有患者均无传染性疾病及家族遗传病史。术前经过患者同意，并签署知情同意书，且实验经过中山大学的伦理学委员会的批准。

方法：

脂肪干细胞的原代培养：采用胰酶消化法和贴壁培养法进行原代培养。经腹部吸脂取下的脂肪组织，转移至超净台，小心剔除血管等组织，剪碎成糜状，用等体积的0.25%胰酶在37 ℃消化45-60 min。离心后以培养基重悬，接种到25 cm²的培养瓶中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂的培养箱中培养，48 h后第1次换液，以后持续隔天换液，直到细胞达到90%以上融合，按1∶3比例传代，取第3代脂肪干细胞备用。

脂肪干细胞的鉴定：

流式细胞学鉴定：取生长融合度大约90%的细胞，常规消化、离心，用含体积分数0.1% 胎牛血清的PBS 重悬，按照10⁶个/流式管分装，进行CD13、CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD45和 HLA-DR鉴定。

成脂肪诱导鉴定：取第3代细胞常规消化，接种到6孔板中，待生长融合达到100%时加入成脂肪诱导液(含体积分数10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素、0.2 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L的IBMX和1%青-链霉素的高糖DMEM培养基)进行诱导，每3 d换液1次，12 d左右进行油红O染色鉴定：吸去成脂保持液，细胞爬片用PBS清洗2次，每次5 min。40 g/L多聚甲醛固定15 min。PBS洗涤2次，每次5 min。油红O染色15 min。体积分数60%异丙醇漂洗，除去多余的染料。PBS洗涤3次，显微镜观察。

成骨诱导鉴定：取第3代细胞常规消化，接种到6孔板，待生长融合80%时，加入成骨诱导液(含体积分数10%胎牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C和1%青-链霉素的低糖DMEM培养基)进行诱导培养，每3 d换液1次，21 d进行茜素红染色鉴定：吸去成骨诱导条件培养基，细胞爬片用PBS洗涤3次，每次5 min；茜素红染色液染色2 min；双蒸水洗涤5-10 s；茜素红分化液洗涤15 s；PBS洗涤3次，显微镜观察。

脂肪干细胞体外向淋巴管内皮细胞分化实验：取第3代细胞常规消化，以细胞浓度为1×10⁸ L^-¹接种到铺有0.5%明胶的12孔板，待生长融合至50%-60%时，分为6组：对照组加入含1%青-链霉素的低糖DMEM培养基培养。其余5组分别加入含25，50，100，200，300 μg/L VEGF-C156s的诱导液(含体积分数5%胎牛血清、10 μg/L碱性成纤维生长因子和1%青-链霉素的低糖DMEM培养基)进行诱导培养。每3 d换液1次，每天记录细胞生长状态。

免疫荧光染色：诱导12 d后，用40 g/L多聚甲醛固定过夜，0.3%Triton X-100破膜，用5%兔血清封闭；然后用羊抗人淋巴内皮细胞透明质酸受体1抗体(1∶50)过夜孵育。再用FITC标记的二抗(1∶300)常温孵育2 h，用DAPI进行细胞核染色，荧光显微镜下观察。采用NIH Image J软件进行荧光强度定量分析。每组随机取5个视野，计算平均荧光强度。

主要观察指标：①脂肪干细胞的鉴定。②淋巴管内皮样细胞的鉴定。

统计学分析：数据以x(_)±s表示。采用SPSS 13.0统计软件处理数据，组间比较采用方差分析及t 检验。P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

世界卫生组织认为淋巴水肿是排在第2位的致残性疾病，治疗极为困难^[10]。从病理生理的角度，淋巴输送管道的重建修复应该是治疗淋巴水肿的最佳选择，但迄今为止并没有令人满意的重建淋巴管的良好方法。因此，如果能利用组织工程技术构建淋巴管，可能为淋巴水肿的治疗研究带来突破。

脉管组织工程是利用种子细胞和生物支架材料来构建脉管的科学，主要包括：种子细胞、支架材料和生物反应器的应用，而种子细胞则被认为是脉管组织工程的基础。有学者利用淋巴管内皮细胞复合聚乳酸支架构建组织工程淋巴管研究^[11]。淋巴管内皮细胞是内膜的重要成分，但是淋巴管内皮细胞作为种子细胞来源有限，限制了其作为种子细胞的应用，因此寻找合适的种子细胞才能解决这一问题^[12]。不同学者通过诱导分化骨髓干细胞及脂肪干细胞得到淋巴管样内皮细胞，为种子细胞的获取带来了希望^[9,13]。相对于骨髓干细胞，脂肪干细胞来源丰富，易于分离培养，作为种子细胞的优势更加明显。 VEGF-C156s是一种突变的血管内皮生长因子C形式，其中156s代表cys156ser，指156位点的半胱氨酸替换成丝氨酸，从而达到使VEGF-C156s只结合血管内皮生长因子受体3，不结合血管内皮生长因子受体2的目的，能够特异性地促进淋巴管内皮细胞的生成^[14]。实验通过不同浓度的VEGF-C156s诱导脂肪干细胞后发现，从第4天开始出现淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性表达，随着诱导时间的延长，荧光强度逐渐增加，从第8天开始荧光强度趋于稳定。25 μg/L VEGF-C156s组中虽然有淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性染色，但是荧光强度较弱，50，100 μg/L VEGF-C156s组淋巴内皮细胞透明质酸受体1阳性染色未见明显的强度差异，而200，300 μg/LVEGF-C156s组第4天开始即可见细胞大量死亡，最后全部死亡，说明VEGF-C156s除能够诱导淋巴管样内皮细胞的生成之外，也能激活脂肪干细胞的凋亡信号通路，导致细胞凋亡，但其具体机制尚不明确，将在未来的研究中，做进一步的探索。

国内外学者研究发现，淋巴内皮细胞透明质酸受体1表达在淋巴管的内表面^[15]，并且淋巴内皮细胞透明质酸受体1也特异性的表达于人类多种正常和肿瘤组织的淋巴管内皮细胞^[16-19]。既往研究表明淋巴内皮细胞透明质酸受体1抗体目前是公认的淋巴管内皮细胞的特异性标志物^[17，20]。本实验中采用VEGF-C156s、碱性成纤维生长因子等生长因子体外诱导脂肪干细胞成淋巴管内皮样细胞，诱导后的免疫荧光结果显示，诱导过程的前2 d并未见有淋巴内皮细胞透明质酸受体1表达，而从第3天开始，淋巴内皮细胞透明质酸受体1逐渐开始表达，并随着时间增加而表达增强，到8-10 d时趋于稳定。因此以VEGF-C156s浓度为50 μg/L诱导8 d，是脂肪干细胞诱导分化为淋巴管样内皮细胞的最佳条件，这将为构架组织工程淋巴管奠定前期研究基础。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程