骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明骨髓间充质干细胞功能状态的改变是骨关节炎的病因之一。
目的：探讨骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性。
方法：收集45例患者的临床资料，其中15例为关节镜下进行膝关节交叉韧带重建患者(对照组)，15例为轻度骨关节炎患者(轻度骨关节炎组)，15例为重度骨关节炎患者(重度骨关节炎组)。体外培养获得3组患者骨髓间充质干细胞，观察其形态变化，检测其增殖能力及软骨向诱导分化能力。
结果与结论：原代骨髓间充质干细胞经24 h培养后呈整齐排列状，且为长梭形，3组骨髓间充质干细胞形态基本一致，不存在显著差异。骨髓间充质干细胞成软骨诱导14 d后行甲苯胺蓝染色鉴定，爬片可见甲苯胺蓝异染颗粒，3组成软骨诱导分化能力无明显差异。CCK-8法检测各组患者骨髓间充质干细胞的增殖能力，其中以对照组增殖能力最强，重度骨关节炎组增殖能力最弱，结果表明骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展之间存在一定的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 骨关节炎, 骨髓间充质干细胞, 细胞功能, 细胞状态, 病情进展, 相关性

Abstract:

BACKGROUND: There is a certain relationship between bone marrow mesenchymal stem cells and articular cartilage, and its cellular functional status is one of the causes of osteoarthritis.
OBJECTIVE: To explore the correlation between functional status of bone marrow mesenchymal stem cells and disease progression in patients with osteoarthritis.
METHODS: The clinical data of 45 patients were collected, including 15 cases undergoing arthroscopic knee cruciate ligament reconstruction (control group), 15 cases of mild osteoarthritis (mild osteoarthritis group), 15 cases of severe osteoarthritis (severe osteoarthritis group). Bone marrow mesenchymal stem cells from three groups were cultured in vitro to observe the morphological changes. Proliferative and differentiation ability was detected and compared between the three groups.
RESULTS AND CONCLUSION: At 24 hours of primary culture, the bone marrow mesenchymal stem cells were arranged in regular pattern and spindle-shaped in the three groups with no morphological differences. At 14 days of chondrogenic induction, toluidine blue staining was positive for bone marrow mesenchymal stem cells, but there was still no difference in the chondrogenic ability in the three groups. Cell counting kit-8 results showed that the proliferative ability of cells was strongest in the control group and weakest in the severe osteoarthritis group. These findings indicate that there is a certain correlation between the functional status of bone marrow mesenchymal stem cells and the progress of the disease.

Key words: Osteoarthritis, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells

中图分类号:

R394.2

刘建. 骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5129-5133.

Liu Jian. Correlation between functional status of bone marrow mesenchymal stem cells and disease progression in osteoarthritis patients [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5129-5133.

图/表（结果） 2

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引言

人体关节内存在软骨，覆盖在关节骨的末端，具有良好的弹性，可以发挥出重要的保护作用^[1]，但是，受到疾病等因素的影响，会出现软骨退变情况^[2]。失去软骨的保护，关节就会发生骨与骨之间的碰撞和摩擦等，导致出现关节疼痛等一系列不良症状，严重影响到患者的正常生活^[3]。骨关节炎即为一种由于关节软骨磨损退化引起的退行性病变，严重影响到患者的生活质量^[4]。临床对骨关节炎患者进行治疗过程中，可以选择多种方式^[5]，常见的治疗方法有药物止痛治疗和物理治疗，以及运动锻炼治疗和关节镜手术治疗等^[6-7]。由于关节软骨随着年龄的增长、损伤等逐渐老化、变性和磨损，几乎不可能再生和修复，因此，各种治疗方法均无法获得满意的临床效果^[8]。近年来干细胞逐渐应用到很多医学领域^[9]，其具有自我再生和多向分化能力。干细胞植入磨损的膝关节腔内，可以不断增殖分化出软骨细胞，修复、再生受损的关节软骨面，从而使患者彻底摆脱关节炎病痛，为临床在保守治疗和具有手术风险的膝关节置换治疗之间开辟了一条新的治疗方法^[10]。骨髓间充质干细胞是一种重要的干细胞类型，其缺失以及功能受损等被认为是骨关节炎的发病原因之一。目前关于骨髓间充质干细胞与骨关节炎疾病进展之间的关系等问题，相关报道较少。为此，本研究探讨骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展的相关性，从而为提高此病的临床治疗效果提供理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：体外观察性实验。

时间及地点：于2015年5至6月在中国石化集团胜利石油管理局胜利医院完成。

对象：关节镜下进行膝关节交叉韧带重建患者(对照组)15例，男9例，女6例；年龄16-65岁，平均(38.8±5.6)岁；受伤至接受重建手术时间为3-24 h，平均(15.6±2.2) h。患者均合并其他韧带损伤，排除同侧膝、踝等关节有手术治疗史或外伤史者，排除半月板全切除患者以及其他原因导致的不利于康复训练患者。

骨关节炎患者30例，男10例，女20例；年龄35-81岁，平均(49.1±2.3)岁，病程1-31年，平均(15.2±1.5)年。患者均经临床影像学诊断确诊为骨关节炎，排除心血管疾病、肝肾疾病、肿瘤以及各种内分泌、结缔组织疾病患者。通过对患者进行侧卧屈曲30°以及膝关节站立前后位、侧位X射线检查，按照K&L评级法(Kellgren and Lawrence Grading Score)进行骨关节炎严重程度分级，15例为轻度骨关节炎患者(轻度骨关节炎组)，15例为重度骨关节炎患者(重度骨关节炎组)。

骨关节炎患者骨髓间充质干细胞培养所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
DMEM 培养基	北京北方同正生物技术发展有限公司
胎牛血清	上海恒远生物科技有限公司
胰酶	上海中西三维药业有限公司
青霉素	陕西博森生物制药股份集团有限公司
链霉素	陕西博森生物制药股份集团有限公司
转化生长因子β1	南宁东恒华道生物科技有限责任公司
地塞米松	陕西博森生物制药股份集团有限公司
显微镜	广州微域光学仪器有限公司
恒温培养箱	天津西格光电科技有限公司
离心机	广州市明美科技有限公司

方法： 骨髓间充质干细胞获取和培养：对照组在股骨和胫骨钻骨性隧道时冲洗收集骨髓，重度骨关节炎组在膝关节置换时获取骨髓，轻度骨关节炎组在陈旧性半月板损伤切除

或关节镜下实施软骨下钻孔和微骨折术时获取骨髓。常规抗凝、离心后弃去上清液。重复操作2次，接种于50 mL培养瓶中，并置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养。连续培养3 d后换液，去除悬浮细胞。

骨髓间充质干细胞传代培养：培养14 d，待原代培养细胞生长达到瓶底面积80%-90%时，添加0.25%胰蛋白酶消化2.0-3.0 min。消化终止后进行离心，弃去上清，加入DMEM培养液吹打均匀后进行稀释，以6×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到100 mm培养皿中，传至第3代细胞进行实验。

流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记：对第3代骨髓间充质干细胞进行抗CD44，CD90，CD34，CD45单克隆抗体及其同型行流式细胞仪检测。

骨髓间充质干细胞增殖能力检测：利用CCK-8法检测各组骨髓间充质干细胞增殖情况。取第3代骨髓间充质干细胞悬液，以每孔(1.0-2.0)×10³细胞密度接种于培养板，置于培养箱中培养24 h，添加10 μL CCK-8继续培养4 h。孵育结束之后，利用酶标仪检测各孔吸光度值，描绘细胞增殖曲线图。

骨髓间充质干细胞向软骨诱导分化能力检测：选取第2代骨髓间充质干细胞进行消化，加入成软骨诱导液(含转化生长因子β1、地塞米松、维生素C、胰岛素、转铁蛋白)进行孵育。诱导14 d 后，用40 g/L多聚甲醛固定细胞，常规操作进行甲苯胺蓝染色，并于镜下观察软骨细胞内异染颗粒情况。

主要观察指标：各组骨髓间充质干细胞形态、增殖情况和成软骨诱导分化能力。

讨论

骨关节炎是一种缓慢进展的致残性关节病，疼痛是骨关节炎最常见的症状，严重影响到患者的正常生活^[11]。临床对骨关节炎患者进行治疗的过程中可以结合患者的实际情况选择不同的方式，包括药物保守治疗和手术治疗等^[12]。骨性关节炎的治疗不是为了缓解疼痛，而是为了解除疼痛，保持或恢复原有关节功能^[13-18]。临床上治疗骨性关节炎的常见方法有中药熏蒸、中药内服、针灸、推拿、离子导入等^[19-21]，这些都是保守性疗法，其目的是提高局部血液循环，改善软组织挛缩，增加关节活动度，阻止关节面的进一步损害来保持关节的正常功能，多用于早期患者^[22]。而对于关节软骨已经出现一定损伤，且关节功能存在明显障碍者，专家建议应及时采用微创治疗，同时配合功能锻炼，以便保障功能的康复^[23]。而对于晚期软骨损伤面积较大，且开始出现关节畸形的患者，则推荐进行关节置换^[24]。不同的治疗方法均具有一定的局限性和不足之处，无法获得满意的临床效果^[25]。随着干细胞技术的不断发展，骨髓间充质干细胞治疗骨关节炎逐渐引起人们的关注^[26-28]。骨髓间充质干细胞是成体干细胞的一种，具有极强的自我更新能力。在体外一定的诱导条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为神经元细胞、软骨细胞、骨细胞、心肌细胞和脂肪细胞等，并可以应用于各种组织工程和再生治疗之中^[29-36]。Kayakabe等^[37]和Liu等^[38]即利用自体骨髓来源间充质干细胞联合透明质酸的方式对兔膝关节软骨缺损进行修复治疗，表明骨髓间充质干细胞在关节软骨缺损修复方面具有一定的应用可行性。但是，关于骨髓间充质干细胞与骨关节炎患者疾病严重程度之间关系的研究相对较少。本研究按照疾病的严重程度对患者进行分析，并进行骨髓间充质干细胞的体外培养。通过对培养结果进行分析可以发现，3组在细胞形态以及软骨诱导结果方面差异无显著性意义。但是，CCK-8检测结果发现，重度骨关节炎组吸光能力最弱，对照组最强。由此可知，对照组的增殖能力显著高于轻度骨关节炎组和重度骨关节炎组。分析出现这一结果的原因，可能是因为骨关节炎患者受到疾病的影响，其骨髓间充质干细胞的增殖能力会显著下降，说明骨关节炎患者骨髓间充质干细胞功能状态与病情进展之间存在一定的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程