人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞调控肝细胞增殖和凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明人端粒酶反转录酶基因的导入可以使骨髓间充质干细胞的生命周期得到显著延长，使其能够继续保持多向分化潜能。
目的：探讨人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞对肝细胞增殖和凋亡的影响。
方法：采取直接贴壁法，分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，利用脂质体转染法，将编码hTERT基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入骨髓间充质干细胞。将hTERT基因转染骨髓间充质干细胞与肝细胞按1︰1共培养(观察共培养组)，同时设未转染骨髓间充质干细胞与肝细胞按1︰1共培养组(对照共培养组)和肝细胞单独培养组，采用MTT比色法和免疫荧光染色法观察骨髓间充质干细胞对肝细胞增殖和凋亡的影响。
结果与结论：观察共培养组的肝细胞增殖率明显高于对照共培养组和肝细胞单独培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)；观察共培养组的肝细胞存活率明显高于肝细胞单独培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以抑制肝细胞的凋亡，并促进其增殖，具有改善肝细胞功能的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 人端粒酶反转录酶基因, 髓间充质干细胞, 肝细胞, 细胞增殖, 细胞凋亡

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that human telomerase reverse transcriptase gene (hTERT) transfection can significantly extend the life cycle of bone marrow mesenchymal stem cells so that the cells can continue to maintain pluripotency.
OBJECTIVE: To investigate the effects of hTERT gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells on hepatocyte proliferation and apoptosis.
METHODS: Bone marrow mesenchymal stem cells from rats were isolated and cultured using direct adherent method. Then, hTERT eukaryotic expression plasmid, pCIneo-hTERT, was transferred into the cells using liposome transfection method. The hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured with hepatocytes at 1:1 (observation group), and meanwhile, non-transfected bone marrow mesenchyam stem cells were co-cultured with hepatocytes at 1:1 (control group), and hepatocytes cultured alone served as single culture group. Effects of bone marrow mesenchymal stem cells on hepatocyte proliferation and apoptosis were observed by MTT assay and immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The proliferative rate of hepatocytes was significantly higher in the observation group than the control and single culture groups (P < 0.05), and the survival rate of hepatocytes was significantly higher in the observation group than the single culture group (P < 0.05). Experimental findings suggest hTERT-modified bone marrow mesenchymal stem cells can inhibit hepatocyte apoptosis but promote hepatocyte proliferation, so as to improve hepatocyte function.

Key words: 干细胞, 骨髓干细胞, 人端粒酶反转录酶基因, 骨髓间充质干细胞, 肝细胞, 细胞增殖, 细胞凋亡

中图分类号:

R394.2

白东，周忠笑，张健. 人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞调控肝细胞增殖和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5118-5122.

Bai Dong, Zhou Zhong-xiao, Zhang Jian. Hepatocyte proliferation and apoptosis under regulation of human telomerase reverse transcriptase gene-modified bone marrow mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5118-5122.

图/表（结果） 3

2.1 骨髓间充质干细胞的形态利用倒置显微镜观察，在培养四五天后，细胞可贴壁生长并呈亮点状，培养7 d时细胞呈长梭形、多角形或纤维状，可见明显集落产生，细胞铺满培养瓶底面，折光性较强。细胞长满后即可进行传代，传代1次后的骨髓间充质干细胞呈漩涡状分布，均一性较好，形态基本一致，纯度达97%以上，见图1。

2.2 免疫细胞化学检测hTERT蛋白的表达在hTERT基因转染骨髓间充质干细胞中hTERT蛋白均表达在细胞核，计数10个高倍视野下的细胞数目，观察到hTERT基因转染骨髓间充质干细胞的hTERT蛋白表达阳性率为90%。2.3 RT-PCR检测hTERT mRNA的表达从RT-PCR产物电泳结果观察到，RT-PCR检测实验组hTERT mRNA的表达明显高于对照组和空白组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.4 流式细胞仪检测肝细胞周期传代接种一两天的肝细胞处于生长潜伏期，在此期的细胞生长不活跃，细胞接种至2-7 d时呈上升趋势，增长活跃。取第5代及第10代肝细胞，流式细胞仪检测观察共培养组处于G₀/G₁期肝细胞为(65.3±0.4)%，S期为(26.6±0.8)%，G₂/M期为(7.3±1.2)%，表明大部分肝细胞处于静止期，符合肝细胞周期的基本特征见表1。 2.5 肝细胞凋亡情况采用荧光染液染色后，放置于荧光显微镜下观察，强度均一的绿色荧光为活细胞，明亮的红色荧光为死细胞。观察共培养组肝细胞存活率(51.38± 0.25)%，明显高于肝细胞单独培养组(35.12±0.23)%，差异有显著性意义(P < 0.05)，观察共培养组肝细胞存活率与对照共培养组(50.02±0.23)%比较，差异无显著性意义，见图3。2.6 MTT比色法观察肝细胞增殖情况培养24 h后，通过MTT比色法测定观察共培养组的细胞吸光度值明显高于肝细胞单独培养组及对照共培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表2。

参考文献

[1] 张业伟,牛坚,赵何伟,等.干细胞表面标志物CD90及端粒酶逆转录酶在原发性肝癌中的表达及临床意义[J].中华肝胆外科杂志, 2012,18(1):37-39.

[2] Thenappan A, Li Y, Kitisin K, et al. Role of transforming growth factor beta signaling and expansion of progenitor cells in regenerating liver. Hepatology. 2010;51(4):1373-1382.

[3] 张莉萍,康格非.原代肝细胞培养的研究现状[J].国外医学:临床生物化学与检验学分册,2004,25(3):193-196.

[4] Liang X, So YH, Cui J, et al. The low-dose ionizing radiation stimulates cell proliferation via activation of the MAPK/ERK pathway in rat cultured mesenchymal stem cells. J Radiat Res. 2011;52(3):380-386.

[5] Kisseleva T, Gigante E, Brenner DA. Recent advances in liver stem cell therapy. Curr Opin Gastroenterol. 2010;26(4):395- 402.

[6] 刘京龙,邓志华,郭素雅,等. Ad-hTERTp-单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷系统联合奥沙利铂对人类肝癌细胞的影响[J].肿瘤研究与临床,2011,23(8):526-531.

[7] Crop MJ, Baan CC, Korevaar SS, et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells induce explosive T-cell proliferation. Stem Cells Dev. 2010;19(12):1843-1853.

[8] 何吉文,李华,向国安,等.肿瘤靶向性细胞穿膜肽介导小分子干扰RNA对肝癌细胞的抑制作用[J].中华实验外科杂志,2013,30(10): 2040-2043.

[9] Shi Y, Xia YY, Wang L, et al. Neural cell adhesion molecule modulates mesenchymal stromal cell migration via activation of MAPK/ERK signaling. Exp Cell Res. 2012;318(17): 2257-2267.

[10] Matuskova M, Hlubinova K, Pastorakova A, et al. HSV-tk expressing mesenchymal stem cells exert bystander effect on human glioblastoma cells. ancer Lett. 2010;290(1):58-67.

[11] 周佳美,向慧玲,朱争艳,等.大鼠骨髓间充质干细胞条件培养基对大鼠肝癌细胞系CBRH,7919增殖能力的影响[J].天津医科大学学报,2011,17(4):455-458．

[12] Lim YS. Acute liver failure in Korea: etiology, prognosis and treatment. Korean J Hepatol. 2010;16(1):5-18.

[13] 邵志红,王培军,李铭华,等.大鼠骨髓间充质干细胞移植对Walker-256肝癌生长影响的实验研究[J].中华医学杂志,2009, 89(7):491-496.

[14] Gilchrist ES, Plevris JN. Bone marrow-derived stem cells in liver repair: 10 years down the line. Liver Transpl. 2010;16(2): 118-129.

[15] Aquino JB, Bolontrade MF, García MG, et al. Mesenchymal stem cells as therapeutic tools and gene carriers in liver fibrosis and hepatocellular carcinoma. Gene Ther. 2010; 17(6):692-708.

[16] Bergfeld SA, DeClerck YA. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells and the tumor microenvironment. Cancer Metastasis Rev. 2010;29(2):249-261.

[17] Park SA, Ryu CH, Kim SM, et al. CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas. Int J Oncol. 2011; 38(1):97-103..

[18] Li GC, Ye QH, Xue YH, et al. Human mesenchymal stem cells inhibit metastasis of a hepatocellular carcinoma model using the MHCC97-H cell line. Cancer Sci. 2010;101(12):2546- 2553.

[19] 林沪,陈黎明,王福生,等.间充质干细胞在肝脏的分化机制研究进展[J].实用肝脏病杂志,2010,13(3):238-240.

[20] Røsland GV, Svendsen A, Torsvik A, et al. Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer Res. 2009;69(13):5331-5339.

[21] Hasebe Y, Hasegawa S, Hashimoto N, et al. Analysis of cell characterization using cell surface markers in the dermis. J Dermatol Sci. 2011;62(2):98-106.

[22] 顾劲扬,施晓雷,张悦,等. 骨髓间充质干细胞维持猪肝细胞形态与功能的实验研究[J].中华肝胆外科杂志,2010,16(2):130-133．

[23] Klopp AH, Gupta A, Spaeth E, et al. Concise review: Dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem Cells. 2011;29(1):11-19.

[24] 沈中,徐小梅,孟琴,等.原代肝细胞体外培养用于利福平和异烟肼肝毒性的研究[J].中国药科大学学报,2005,36(3):250-253.

[25] Zou C, Luo Q, Qin J, et al. Osteopontin promotes mesenchymal stem cell migration and lessens cell stiffness via integrin β1, FAK, and ERK pathways. Cell Biochem Biophys. 2013;65(3):455-462.

[26] Abdel aziz MT, El Asmar MF, Atta HM, et al. Efficacy of mesenchymal stem cells in suppression of hepatocarcinorigenesis in rats: possible role of Wnt signaling. J Exp Clin Cancer Res. 2011;30:49.

[27] Ho IA, Chan KY, Ng WH, et al. Matrix metalloproteinase 1 is necessary for the migration of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells toward human glioma. Stem Cells. 2009;27(6):1366-1375.

[28] Han Z, Jing Y, Zhang S, et al. The role of immunosuppression of mesenchymal stem cells in tissue repair and tumor growth. Cell Biosci. 2012;2(1):8.

[29] 王雪峰,梅佳玮,廖传文,等.骨髓间充质干细胞与小鼠肝癌肝移植术后复发关系的实验观察[J].中华医学杂志,2014,94(6): 455-458.

[30] Gao P, Ding Q, Wu Z, et al. Therapeutic potential of human mesenchymal stem cells producing IL-12 in a mouse xenograft model of renal cell carcinoma. Cancer Lett. 2010; 290(2):157-166.

引言

材料方法

设计：细胞水平观察实验。

时间及地点：实验于2013年2月至2014年3月在沈阳医学院实验室完成。

材料：

人端粒酶反转录酶基因修饰骨髓间充质干细胞调控肝细胞增殖和凋亡实验所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
DMEM/F12培养液、胎牛血清	上海宝曼生物科技有限公司
质粒pCIneo-hTERT	美国Hyclone公司
胰蛋白酶	北京天根生化有限公司
兔抗鼠NgR基因抗体、β-actin兔抗鼠多克隆抗体	美国KPL公司
mRNA提取试剂盒、PCR反应试剂盒	华美生物工程公司
MTT试剂盒	美国Santa Cruz 公司
端粒酶反转录酶	晶美生物技术有限公司
细胞周期检测试剂盒	美国Gibco BRL公司
OLYMPUS IX71荧光倒置相差显微镜	武汉博士德生物工程有限公司
CO₂培养箱	美国Hyclone公司
流式细胞仪	北京博奥森公司

实验动物：1月龄的SD大鼠30只，雌雄不限，体质量220-250 g，购自中国医学科学院动物实验室，动物质量合格证号：SCXK20060008，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的培养：将1月龄SD大鼠处死，浸入体积分数为75%乙醇中消毒10 min，按无菌操作原则，分离双侧胫骨和股骨，剔除骨端后利用10号注射器吸取 1 mL DMEM完全培养基，自一端开始冲出骨髓，制成单细胞悬液，将细胞按3×10⁷ L^-¹细胞浓度接种到100 mL培养瓶中，放置到37 ℃、体积分数为5% CO₂及饱和湿度的培养箱中培养，观察24 h后给予全部换液，每3 d换液1次，按1∶2比例进行传代，期间逐日观察细胞的生长状况，当细胞融合率达80%-90%时，以1∶3的比例进行下一次传代。细胞通过多次传代、扩增及培养，使骨髓间充质干细胞逐渐获得纯化、扩增。第4代骨髓间充质干细胞在体外培养融合达到80%后给予换液，随之加入含BrdU的培养基进行标记。

肝细胞的分离、培养：采取直接分离法分离肝细胞，将SD大鼠用乙醚麻醉后处死，腹部用体积分数为75%乙醇进行常规消毒后，于正中切开腹腔，取出体内的肝脏，PBS充分清洗后，分离出肝组织被膜，再将其剪切成1 mm³的小块组织，以30 mL/min的D-Hank’s液进行充分的灌流以清除肝内血液，充分洗涤后经过挤压、研磨、剪碎、振荡、吹打等机械方法获得单个肝细胞，计算细胞存活率，加入DMEM/F12培养液，调节细胞悬液浓度为1×10⁷ L^-¹-4×10⁹ L^-¹，以2 mL/瓶分装好细胞悬液，封口，放置在37 ℃下，恒温静置培养，每天根据培养液颜色变化更换培养液。

hTERT电转染骨髓间充质干细胞：将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液，PBS清洗并经胰酶消化后，离心收集骨髓间充质干细胞，用电穿孔缓冲液重悬，800×g离心，静置5 min，清洗细胞3次，离心，重悬于电转液中，转移至电击杯，加入20 μg的质粒DNA，混匀，放置冰上30 min后，以电压350 V/cm，电容25 μF，时间为0.9 ms的电转化参数，进行电穿孔。将转染后的细胞，放置于室温30 min，移入含DMEM培养基，体积分数为10%小牛血清，1%双抗的培养皿中，37 ℃、体积分数为5% CO₂孵箱内培育。

免疫细胞化学检测hTERT基因转染骨髓间充质干细胞中hTERT蛋白表达：取第3代骨髓间充质干细胞，根据pCIneo-hTERT转染情况分为3组：对照组(正常骨髓间充质干细胞)、空载质粒组、hTERT转染组。逐日观察细胞生长状况，待其融合率达70%时，以多聚甲醛固定30 min采用S-P 法进行免疫组化染色。

RT-PCR检测hTERT基因转染骨髓间充质干细胞中hTERT mRNA的表达：取第3代骨髓间充质干细胞，根据pCIneo-hTERT转染情况分为3组：对照组(正常骨髓间充质干细胞)、空载质粒组、hTERT转染组。根据文献[15]采用TRIzol法提取3组骨髓间充质干细胞总RNA，按试剂盒说明进行RT-PCR。内对照β-actin上游引物为5’-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3’，下游引物为5’-CTC AGC CTT GAC TGT GCC-3’，产物大小151 bp；hTERT上游引物为5’-CTG AAG TGT CAC AGC CTG TTT-3’，下游引物为5’-CAC ACA TGC GTG AAA CCT GTA-3’，产物大小111 bp；反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s、62 ℃退火 50 s、72 ℃延伸1 min进行反应，35个循环后，72 ℃延伸8 min。PCR产物行2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶自动成像及分析系统，观察mRNA条带表达的吸光度值。

肝细胞与骨髓间充质干细胞共培养：实验分为骨髓间充质干细胞与肝细胞共培养组(对照共培养组)，hTERT基因转染骨髓间充质干细胞与肝细胞共培组(观察共培养组)以及肝细胞单独培养组。两组细胞以1∶1比例进行共培养，加入DMEM/F12培养液，调节2种细胞悬液浓度为1×10⁷ L^-¹-4×10⁹ L^-¹，以2 mL/瓶分装好细胞悬液，封口，放置在37 ℃下，恒温静置培养，每天根据培养液颜色变化更换培养液。

流式细胞仪检测肝细胞周期变化：共培养3 d，弃去培养液后采用胰酶消化收集细胞，将细胞吹打制成细胞悬液，PBS洗涤2遍，-20 ℃预冷，体积分数为75%乙醇进行固定，于4 ℃下保存待用；以1 500 r/min离心5 min后去除体积分数为75%的乙醇固定液；PBS洗涤细胞，以 1 000 r/min离心5 min后放置含50 mg/L碘化丙啶、0.2%渗透剂(Triton X-100)的PBS中，于4 ℃下避光培育 30 min，分析细胞周期。

诱导肝细胞凋亡：采用放线菌素D及肿瘤坏死因子α诱导肝细胞的凋亡，将细胞接种在50 μL/cm²基底膜基质上，以2×10⁵/cm²预铺底置12孔板内，在常规培养5 d后，将放线菌素D(0.2 mg/L)加入培养基内1 h，随之加入肿瘤坏死因子α(30 μg/L)来诱导细胞凋亡，培养8 h后观察细胞的活性。细胞存活率=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)。

MTT比色法观察骨髓间充质干细胞对正常肝细胞增殖的影响：共培养3 d后，按1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种于5个96孔培养板中，每组设11个复孔，另设1孔为只加培养液的空白对照，于每孔加入200 μL的DMEM/F12培养液，置于培养箱内培育；24 h后待细胞贴壁，随机选取1个96孔板，每孔加入20 μL的MTT，再置入培养箱内培育4 h；丢弃上清后滴加150 μL二甲基亚砜，于37 ℃下振荡30 min；采用全自动酶标仪测量540 nm波长处的吸光度值。

统计学分析：数据用SPSS 17.0软件包处理。计量资料以x(_)±s表示，两组间连续变量比较用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析及q检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

多项实验研究表明骨髓间充质干细胞对人体器官组织具有再生作用^[16-17]，另有研究发现，骨髓间充质干细胞对终末期肝病患者的治疗也很有发展潜力^[18-20]。骨髓间充质干细胞移植到爆发性肝衰模型大鼠体内，结果发现不仅可以明显改善病死率，还检测出大量肝细胞生长刺激因子，且移植骨髓间充质干细胞组生长因子的表达量比未移植骨髓间充质干细胞组显著升高^[21-23]；另有研究显示，将骨髓间充质干细胞输注到30%肝移植大鼠体内，发现其对肝细胞具有促有丝分裂和抗凋亡作用^[24-26]，这些研究结果均表明，在肝再生方面骨髓间充质干细胞是起肯定作用的。采用直接分离法分离肝细胞，具有操作流程短、分离获得肝细胞的数量较多、不需复杂的仪器和昂贵的胶原酶、影响因素较少、分离效果较好等优点，虽然通过此法获得的肝细胞数目低于酶法，但能满足一般实验的要求，还是适合推广应用。随着医疗技术的发展，人们认识到端粒的长度与细胞的衰老有密切关联^[27-29]。研究表明hTERT基因的导入可以使骨髓间充质干细胞的生命周期得到显著延长，使其能够继续保持多向分化潜能，更好的向肝样细胞分化，以抑制肝细胞的凋亡、刺激肝细胞的再生^[30]。实验将编码hTERT基因的真核表达质粒pCIneo-hTERT导入骨髓间充质干细胞，通过RT-PCR检测实验组hTERT mRNA的表达明显高于对照组和空白组。通过流式细胞仪检测结果表明，实验组大部分肝细胞处于静止期，符合肝细胞周期的基本特征。MTT检测结果表明，加入hTERT基因转染骨髓间充质干细胞的肝细胞增殖率明显增加，说明hTERT修饰的骨髓间充质干细胞可以刺激肝细胞再生。诱导肝细胞凋亡实验检测结果表明，加入hTERT基因转染骨髓间充质干细胞的肝细胞存活率明显增高，证明了骨髓间充质干细胞具有直接抗细胞凋亡作用，提示经hTERT修饰的骨髓间充质干细胞可以更好促进受损肝细胞的功能修复。

综上所述，在肝病治疗方面骨髓间充质干细胞移植有着广泛的应用前景，骨髓间充质干细胞可直接取材于患者本人，避免了同种异体移植引发的免疫排异反应，易于体外培养扩增，没有伦理学争端等众多优点。近年来有研究发现，骨髓间充质干细胞不仅能替代肝细胞移植，还可以在早期促进损伤肝脏的修复，大量文献研究均证明移植骨髓间充质干细胞可以代替受损肝脏的部分功能，但是对于移植的骨髓间充质干细胞能否通过上调基因的表达来补偿自身的功能缺陷还尚未有定论，且对于骨髓间充质干细胞移植治疗肝功能衰竭的某些作用机制目前尚未明确，这些疑问还需进一步研究探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程