miR-155有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年发现，miRNA是能够对基因表达产生影响的一种新型调控子，miRNA有助于多能干细胞分化增殖以及自我更新。
目的：探讨miR-155对大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化的调控机制。
方法：12周龄健康SD大鼠60只，随机分为研究组与对照组，每组30只。于麻醉状态下将大鼠处死，获取下肢骨髓，进行骨髓间充质干细胞分离、培养，研究组给予miR-155基因模拟物转染，对照组给予阴性对照序列转染，经成软骨诱导分化后进行RT-PCR检测Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因的表达，Western blot检测Sox9、Runx2蛋白的表达。
结果与结论：研究组Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表达高于对照组，Collagen X基因表达低于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。研究组Sox9蛋白表达高于对照组，Runx2蛋白表达低于对照组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果表明miR-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化，而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 成软骨分化, miR-155, 骨髓间充质干细胞, Sox9, Runx2, 调控机制

Abstract:

BACKGROUND: It is discovered recently that miRNA is a new regulator that is able to have an impact on gene expression and miRNA contributes to proliferation, differentiation and self-renewal of pluripotent stem cells.
OBJECTIVE: To investigate the mechanism by which miR-155 regulates chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.
METHODS: Sixty healthy Sprague-Dawley aged 12 weeks were randomized into study group and control group, with 30 in each group. Under anesthesia, rats were sacrificed to harvest bone marrow of the lower limbs. Then bone marrow mesenchymal stem cells were isolated, cultured, and transfected with miR-155 mimics in the study group and a negative control sequence in the control group. After chondrogenic induction, RT-PCR was used to detect the expressions of Sox9, Collagen II, Aggrecan and Collagen X gene, and western blot assay to detect the expression of Sox9 and Runx2 proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the mRNA expressions of Sox9, Collagen II and Aggrecan were higher, but the mRNA expression of Collagen X was lower in the study group (P < 0.05); the protein expression of Sox9 was higher, but the protein expression of Runx2 was lower in the study group (P < 0.05). These findings indicate that miR-155 promotes the chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and moreover, it can suppress the hypertrophy trend of bone marrow mesenchymal stem cells differentiating into chondrocytes.

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, MicroRNAs, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

设计：细胞水平观察性实验。

时间及地点：实验于2009年1月至2012年12月在济南市第四人民医院进行。

材料：

实验动物：12周龄健康SD大鼠60只，雌性，体质量180-270 g，由山东大学动物实验中心提供。

miR-155促进大鼠骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化实验所用主要试剂：
试剂	来源
Reagent TRIzol、RNAiMAX Lipofectamine^TM转染试剂	Invitrogen公司
一抗、过氧化物酶辣根偶联二抗	Cruz Santa公司
miRNA模拟物、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶	瑞博公司
胎牛血清、F12、DMEM培养基	GIBCO公司
dNTP、Taq聚合酶、RT-PCR试剂盒	MBI公司
ECL试剂盒	碧云天公司
软骨诱导液	赛业公司
Green supermix IQSTBR	Rad-Bio公司
蛋白定量试剂盒、番红O染液	博士德生物武汉分公司

实验方法：

骨髓间充质干细胞分离、培养：选取12周龄健康SD大鼠60只，于麻醉状态下将大鼠处死，分离大鼠的双侧下肢，剪断骨骺端，冲出骨髓腔内骨髓，以PBS轻吹打法进行单细胞悬液的制备，1 200 r/min离心10 min，弃上清，以F12/DMEM培养基进行细胞重悬，接种于25 cm²培养瓶，于体积分数为5%CO₂、37 ℃环境下培养，间隔2 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态特征、生长状况。当接近细胞融合状态时，以0.25%胰蛋白酶进行消化，传代比例为1︰2。

骨髓间充质干细胞转染miR-155基因：将第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板，达50%-60%融合时以RNAiMAX Lipofectamine^TM实施细胞转染。研究组给予miR-155基因模拟物转染，对照组给予阴性对照序列转染，转染量均为300 pmol。转染36 h后对骨髓间充质干细胞进行成软骨诱导分化，以离心法进行软骨微团的构建。

诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化：制备细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，将细胞悬液移入离心管进行离心，弃上清，轻轻加入软骨诱导液(含50 mg/L抗坏血酸、体积分数为1%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、100 mg/L丙酮酸钠、1.0%吲哚美辛、40 mg/L L-脯氨酸、低糖DMEM培养基)，防止冲散细胞团，在体积分数为5%CO₂、37 ℃环境下继续培养，间隔3 d更换1次软骨诱导液，诱导2周软骨团块形成。

番红O染色：软骨团块应用40 g/L多聚甲醛固定，切片石蜡包埋，1%盐酸乙醇分化以清水冲洗，0.1%番红O染色5 min，体积分数为95%乙醇脱水，漂洗，封固。

RT-PCR检测各组细胞Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因表达：成软骨分化诱导7 d后收集骨髓间充质干细胞，加入Trizol核酸提取液，提取各组细胞总RNA，依据反转录试剂盒说明书步骤操作，完成反转录获取cDNA，对反转录产物予以RT-PCR检测。以SYBR Green Ⅰ荧光染料标记引物，见表1。反应结束读取PCR仪Ct值，将GAPDH作内参，完成相应计算。

Western blot检测各组细胞Sox9、Runx2蛋白表达：成软骨分化诱导7 d后收集细胞，以RIPA缓冲液进行细胞裂解，提取细胞总蛋白，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒操作说明测定总蛋白浓度。等量总蛋白采用PAGE-SDS法分离后转移至硝化纤维膜，5%脱脂牛奶封闭，加入兔抗大鼠Runx2、Sox9一抗孵育(1∶200)，4 ℃过夜，TBST缓冲液充分漂洗后加入抗兔二抗(经过氧化物酶辣根偶联)，于室温下孵育2 h，采用化学发光法ECL显影，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果，以β-actin为内参，计算蛋白表达的相对变化。

主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态。②miR-155转染结果。③成软骨诱导分化后番红O染色结果。④成软骨诱导分化后两组细胞Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan、Collagen X基因表达。⑤成软骨诱导分化后两组细胞Sox9、Runx2蛋白表达。

统计学分析：采用SPSS 19.0软件对数据予以统计处理，其中计量资料以x(_)±s表示，数据对比选择t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨的再生能力十分有限，很小的创伤也会导致严重疼痛和关节功能障碍。体外构建与关节软骨具有相同生物学特性的软骨组织来修复软骨缺损是一种较好的治疗骨性关节炎的策略^[7-11]。目前自体软骨移植为最常见的修复关节软骨缺损的方式。自体软骨移植是指分离人体内的软骨细胞并通过体外单层培养扩增软骨细胞，最后将扩增后的软骨细胞再移植回关节软骨缺损处^[12-15]。体外培养的关节软骨通常都会发生去分化，这意味着细胞外基质中透明软骨特异性的CollagenⅡ和Aggrecan表达会发生下调而代表软骨发生肥大的Collagen X等表达会发生上调^[16-19]，因此自体软骨移植构建的软骨组织通常不是透明软骨，关节软骨缺损修复的效果也十分有限^[20-21]。
自体软骨移植的另一种替代方法为体外通过干细胞和生物材料构建软骨组织，其中骨髓间充质干细胞成为一种非常有吸引力的细胞^[22]。为了完成这一目的，有必要充分了解骨髓间充质干细胞定向成软骨分化的分子机制^[23]。miRNA为内源性的RNA分子，其在体内许多生物反应过程中都发挥着重要的作用，包括软骨形成等^[24-26]。miRNA通过与mRNA的3’端非翻译区结合来诱导mRNA的降解或翻译抑制^[27]。有研究人员通过芯片分析研究显示，成软骨分化的骨髓间充质干细胞中miR-155含量明显高于发生去分化的软骨细胞，这也为后续研究提供了思路^[28-30]。骨髓间充质干细胞能够分化为不同的组织如骨、软骨和脂肪组织等。许多研究显示骨髓间充质干细胞的成骨分化是高度程序化的过程，它主要由转录因子Runx2调控并最终导致细胞外基质中钙质的沉积，而骨髓间充质干细胞的成软骨分化主要由转录因子Sox9来进行调控，它诱导细胞内CollagenⅡ和硫酸软骨素等基因的表达^[31-34]。体外诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化无一避免都存在一个重要的缺陷那就是体外构建的软骨组织很难具有稳定的软骨表型，在成软骨分化后期，Runx2的表达会逐渐增加并导致Collagen X等肥大软骨特异性蛋白表达^[35-38]，进而导致获得的工程化软骨质量下降而难以与透明软骨相比较，在最终进行体内关节软骨缺损修复时，工程化软骨组织很难与周围软骨进行良好的融合生长^[39-40]。研究发现miR-155可以促进大鼠骨髓间充质干细胞成软骨分化过程中细胞外基质硫酸软骨素的表达。研究组Sox9、CollagenⅡ、Aggrecan基因表达高于对照组，差异有显著性意义，Collagen X基因表达低于对照组，差异有显著性意义。此外，研究组Sox9蛋白表达高于对照组，而Runx2蛋白表达低于对照组，差异均有显著性意义，说明miR-155不仅有助于骨髓间充质干细胞成软骨分化，而且可以抑制骨髓间充质干细胞成软骨分化呈肥大趋势发展，既为应用骨髓间充质干细胞构建稳定软骨表型的软骨组织奠定了理论基础，也提供了制定骨性关节炎治疗方案的实验依据，具有非常重要的临床价值。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程