三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.001

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (32): 5085-5091.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.001

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三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响

李文凯，张英弛，韦盛，杨勇，吴华

华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030

出版日期:2015-08-06 发布日期:2015-08-06
通讯作者: 杨勇，博士，主治医师，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030
作者简介:李文凯，男，1988年生，河南省信阳市人，汉族，在读博士，主要从事骨质疏松及骨髓间充质干细胞的研究。
基金资助:
国家自然科学基金青年基金资助项目(81301552)

Regulating osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by extracellular adenosine triphosphate

Li Wen-kai, Zhang Ying-chi, Wei Sheng, Yang Yong, Wu Hua

Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Online:2015-08-06 Published:2015-08-06
Contact: Yang Yong, M.D., Attending physician, Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
About author:Li Wen-kai, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81301552

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓间充质干细胞的功能紊乱是骨质疏松的重要病理机制，而适当力学刺激可促进骨生长、提高骨强度，同时也会使细胞分泌腺苷类物质，如三磷酸腺苷。
目的：探讨三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂肪分化的影响及其相关机制。
方法：不同浓度(10，50，250 μmol/L)的三磷酸腺苷刺激骨髓间充质干细胞，通过RT-qPCR检测成骨和成脂肪相关基因表达、茜素红染色和油红O染色来评估三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响。Western blot检测三磷酸腺苷刺激对ERK1/2通路激活的影响。
结果与结论：三磷酸腺苷促进骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达和钙沉积，抑制成脂肪相关基因表达和脂滴生成，但不影响细胞增殖，这些影响呈剂量依赖性。三磷酸腺苷可以激活ERK1/2通路，ERK1/2通路抑制剂U0126抑制了三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞的促成骨抑成脂效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 三磷酸腺苷, 骨髓间充质干细胞, 成骨分化, 成脂分化, ERK信号通路, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Impaired balance between osteogenesis and adipogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells is a crucial pathological mechanism of osteoporosis. Mechanical loads applied to bone tissue can increase bone formation and improve bone strength, and meanwhile lead to the release of extracellular nucleotides, such as adenosine triphosphate.
OBJECTIVE: To determine the effects of adenosine triphosphate on the osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells and to investigate the underlying mechanisms.
METHODS: The effect of adenosine triphosphate (10, 50, 250 μmol/L) on differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells were measured by osteogenic and adipogenic related genes expression, alizarin red staining and oil red O staining. The activation of ERK1/2 signaling pathway by adenosine triphosphate was tested using western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: Incubation of bone marrow mesenchymal stem cells with adenosine triphosphate resulted in the dose-dependent increase of osteogenic genes expression and calcium deposition, and inhibition of adipogenic genes expression and lipid droplet formation, but had no effects on cell proliferation. Adenosine triphosphate activated ERK1/2 signaling pathway, and U0126 as an ERK1/2 inhibitor restrained the effect of adenosine triphosphate on the differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Adenosine Triphosphate, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

李文凯，张英弛，韦盛，杨勇，吴华. 三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(32): 5085-5091.

Li Wen-kai, Zhang Ying-chi, Wei Sheng, Yang Yong, Wu Hua. Regulating osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by extracellular adenosine triphosphate[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(32): 5085-5091.

图/表（结果） 3

2.1 三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响为了检测三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞分化的影响，首先用3个不同浓度的三磷酸腺苷(10，50，250 μmol/L)刺激骨髓间充质干细胞并在普通培养基中培养 7 d，提取RNA做RT-qPCR检测。与对照组相比，三磷酸腺苷刺激组的成骨相关基因(RUNX2，ALP和OPN)表达明显升高，而成脂相关基因(PPARγ，FABP4和Adipsin)表达明显降低，其中以 250 μmol/L浓度的影响最显著(图1A)。其次，为了检测三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响，用3个浓度的三磷酸腺苷(10，50，250 μmol/L)分别作用于骨髓间充质干细胞0，3，7 d，CCK-8试剂盒检测发现3个浓度的三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞的增殖均没有影响(图1B)。因为250 μmol/L三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞分化的影响最显著，并且对其增殖也没有影响，因此后面的实验中均使用250 μmol/L三磷酸腺苷来刺激骨髓间充质干细胞。2.2 三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞钙沉积和脂滴生成的影响将骨髓间充质干细胞分别在成骨和成脂诱导培养基中培养7-21 d，每3 d换液1次，换液时加入250 μmol/L 三磷酸腺苷。7 d时用RT-qPCR检测三磷酸腺苷对成骨和成脂相关基因的表达情况，21 d时进行茜素红和油红O染色。实验结果显示三磷酸腺苷可以明显的增加成骨基因(RUNX2，ALP和OPN)的表达(图2A)、减少成脂相关基因(PPARγ，FABP4和Adipsin)的表达(图2A)、钙结节的数量(图2B)、减少脂滴的生成(图2C)。

2.3 ERK1/2通路在三磷酸腺苷影响骨髓间充质干细胞分化中的作用用250 μmol/L 三磷酸腺苷分别刺激骨髓间充质干细胞0，5，10，20，30，60 min后，提取蛋白，Western blot检测ERK1/2蛋白的磷酸化情况。结果发现在加入三磷酸腺苷5 min后，ERK1/2的磷酸化表达就显著增加，到20 min时开始衰减并一直持续到60 min，其中磷酸化最明显的是三磷酸腺苷刺激后5 min(图3A)。此外，当ERK1/2通路的抑制剂U0126(5 μmol/L)先作用于骨髓间充质干细胞30 min，再用三磷酸腺苷刺激骨髓间充质干细胞5 min，Western blot检测发现ERK1/2的磷酸化几乎被完全抑制(图3B)。实验用ERK1/2通路的抑制剂U0126作用于骨髓间充质干细胞30 min以阻断ERK1/2信号通路，接着用三磷酸腺苷(250 μmol/L)刺激骨髓间充质干细胞并在骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中孵育7 d，使用RT-qPCR分别检测成骨和成脂基因的表达情况。实验结果发现三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞的促成骨基因表达和抑成脂基因表达的效应被U0126部分阻断(图4)。

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引言

骨质疏松症是一种全身性的骨代谢障碍性疾病，以骨量减少、骨微结构退化、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性疾病^[1]。随着社会逐渐进入老龄化，骨质疏松症也日趋成为影响健康的主要疾病，对骨质疏松治疗方面的研究就显得更加重要。目前骨质疏松的发病机制还没有完全清楚，对骨质疏松症的更进一步研究发现骨髓间充质干细胞的功能紊乱是骨质疏松的发病机制之一^[2-4]。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，来源于中胚层，在一定的激素或生长因子刺激下可以向骨、软骨、脂肪分化，是骨组织工程的理想种子细胞。Runx2和PPARγ分别是骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞和脂肪细胞的主要转录因子^[5-6]。目前认为促进骨髓间充质干细胞成骨分化的因子同时也会抑制其成脂分化，反之亦然^[7-12]。一旦骨髓间充质干细胞向成脂分化增加，而成骨分化减少，骨髓内的脂肪含量就会增加，从而导致成骨细胞凋亡、破骨细胞增殖，进而使骨吸收增加及骨量丢失^[13-15]。

骨是一种力学器官，Wolf等^[16]在1973年就发现应力刺激可促进骨折的愈合。适当的负重与功能锻炼有助于促进新骨生成和增加骨的强度^[17]。大量文献表明腺苷类物质如三磷酸腺苷，在机械力学转导中起重要作用^[18-20]。三磷酸腺苷不仅是体内能量的直接应用形式，同时也是重要的信号分子，它可以作用于嘌呤受体和激活某些信号通路来发挥信号因子的作用。本实验研究三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨分化和成脂分化的影响及其相关机制，为进一步认识机械应力的生物转导和治疗骨质疏松的药物靶点开发提供帮助。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：分组对照观察实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室完成。

材料：

三磷酸腺苷干预大鼠骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化实验所用主要试剂和仪器：
试剂及仪器	来源
三磷酸腺苷	Sigma公司
ERK1/2抗体	CST(Cell Signaling Technology)公司
U0126，RIPA蛋白裂解液	上海碧云天生物技术有限公司
反转录试剂盒及PT-QPCR试剂盒	北京全式金生物技术有限公司
Trizol试剂盒，引物设计及合成	Invitrogen 公司
CCK-8试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
电泳仪、半干电转膜仪和凝胶成像仪	美国 Bio-Rad 公司
SD大鼠骨髓间充质干细胞普通培养基、成骨和成脂诱导培养基	赛业(广州)生物科技有限公司

实验动物：4周龄雄性SD大鼠6只，体质量80 g左右，购自湖北省实验动物中心，许可证号：SCXK(鄂)2008- 0005。

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离、培养和纯化：大鼠脱臼处死后，无菌条件下取出双侧股骨和胫骨。在股骨和胫骨干骺端处剪断，用5 mL无菌注射器抽取SD大鼠骨髓间充质干细胞培养液反复冲洗骨髓腔。将冲洗液反复吹打混匀，制成细胞悬液后转移至25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱内培养。48 h后首次换液，以后每3 d换液1次。当细胞生长融合达80%以上，以0.25%胰酶消化后按1∶3的比例转入75 cm²培养瓶中。用上述方法传代2次，获得第3代骨髓间充质干细胞备用。

CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力：收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100 μL铺板使待测细胞密度调整至5 000个/孔，加入浓度梯度的三磷酸腺苷(10，50，250 μmol/L)，每个梯度设5个复孔。分别在孵育0，3，7 d后每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内继续孵育 1 h后，于450 nm处测定吸光度值。

实时荧光定量PCR测定基因的表达：不同浓度的三磷酸腺苷刺激7 d，用Trizol试剂盒一步法提取各组细胞总RNA(具体步骤按Trizol试剂盒操作说明书进行)，分光光度计检测RNA的浓度及纯度。用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA：取1 μg总RNA，加入随机引物及缓冲液，共20 μL体系，瞬时离心，于PCR仪上30 ℃，10 min；42 ℃，20 min；99 ℃，5 min；4 ℃，5 min，瞬时离心，于-20 ℃冰箱中保存备用。荧光定量PCR反应：按全式金RT-PCT试剂盒操作说明书进行，于八联管中加入引物、cDNA、混合体系及无RNA酶纯水，共10 μL，每个样品设3个复孔，瞬时离心；置于荧光定量PCR仪上(Bio-rad IQ5)，95 ℃预变性1 min，95 ℃变性 15 s，58 ℃退火、延伸、检测荧光，机器预设熔解曲线程序。

实时荧光定量PCR引物序列：
基因	引物序列
GAPDH	上游(5’-3’)：GGC ACA GTC AAG GCT GAG AAT G 下游(5’ -3’)：ATG GTG GTG AAG ACG CCA GTA
RUNX2	上游(5’-3’)：GCA CCC AGC CCA TAA TAG A 下游(5’ -3’)：TTG GAG CAA GGA GAA CCC
PPARγ	上游(5’-3’)：CCT TTA CCA CGG TTG ATT TCT C 下游(5’ -3’)：GGC TCT ACT TTG ATC GCA CTT T
ALP	上游(5’-3’)：CAA GGA CCA ACT ACA ACC A 下游(5’ -3’)：AGG GAA GGG TCA GTC AGG TT
OPN	上游(5’-3’)：CCT GGA CCT CAT CAG CAT TT 下游(5’ -3’)：GGA GAC AGG AGG CAA GG
Adipsin	上游(5’-3’)：CAC GTG TGC GGT GGC ACC CTG 下游(5’ -3’)：CCC CTG CAA GTG TCC CTG CGG T
FABP4	上游(5’-3’)：GCG TAG AAG GGG ACT TGG TC 下游(5’ -3’)：TTC CTG TCA TCT GGG GTG ATT

U0126对三磷酸腺苷作用于骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响：用ERK1/2通路的抑制剂U0126(5 μmol/L)作用于骨髓间充质干细胞30 min以阻断ERK1/2信号通路，接着用三磷酸腺苷(250 μmol/L)刺激骨髓间充质干细胞，并在骨髓间充质干细胞成骨诱导培养基和成脂诱导培养基中孵育7 d，RT-qPCR分别检测成骨和成脂基因的表达。

茜素红染色及油红O染色：将骨髓间充质干细胞以 20 000个/cm²的密度接种于6孔板，待细胞完全长满后，分别用成骨诱导培养基和成脂诱导培养基培养骨髓间充质干细胞21 d，每3 d换液1次，每次换液时实验组加入三磷酸腺苷(250 μmol/L)。21 d后，吸去培养基，PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛固定15 min，双蒸水洗1遍，分别用4%茜素红或油红O染液染色30 min，双蒸水洗2遍，在显微镜下观察拍照，所得图片用图像分析软件进行分析。

Western blot测定蛋白表达：在研究三磷酸腺苷对ERK1/2信号通路影响的实验中，用250 μmol/L三磷酸腺苷分别刺激骨髓间充质干细胞0，5，10，20，30，60 min，提取蛋白，Western blot检测ERK1/2蛋白的磷酸化情况。在研究U0126对三磷酸腺苷激活ERK1/2信号通路激活影响的实验中，先用U0126(5 μmol/L)作用于骨髓间充质干细胞30 min，接着用三磷酸腺苷(250 μmol/L)刺激骨髓间充质干细胞5 min，提取蛋白，Western blot检测ERK1/2蛋白的磷酸化情况。①蛋白提取：细胞用PBS洗3遍，每孔加入RIPA细胞裂解液100 μL于冰上裂解30 min，收集裂解液于1.5 mL离心管中，离心半径10 cm，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，吸取上清，即为蛋白质溶液。用BCA法测蛋白浓度，调整浓度后加入上样缓冲液(Loading Buffer)，99 ℃变性5 min，于-20 ℃冰箱中保存。②Western blot：取20 μg蛋白于12%的SDS-PAGE胶中电泳，浓缩胶恒压75 V，50 min，分离胶恒压120 V，1.5 h；恒流200 mA 2 h将蛋白转至直径为0.45 μm的PVDF膜上，用5%脱脂奶粉(TBST配置)封闭1 h；4 ℃条件下孵育一抗过夜。用TBST洗膜(每次洗15 min，共洗3次)，37 ℃孵育二抗1 h，再用TBST洗膜(每次洗15 min，共洗3次)，暗室内曝光。

主要观察指标：①三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞增殖的影响。②三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂基因表达的影响。③三磷酸腺苷对ERK1/2通路的激活情况。④U0126(ERK1/2信号通路抑制剂，5 μmol/L)对骨髓间充质干细胞成骨和成脂基因表达的影响。

统计学分析：应用SPSS 19.0软件包作统计学处理，计量资料用x(_)±s表示，采用ANOVA方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化失衡是骨质疏松的重要病理机制^[2-4]，因此调节骨髓间充质干细胞的成骨和成脂分化可以作为治疗骨质疏松的一个靶点和治疗途径。实验结果显示三磷酸腺苷可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并抑制成脂肪分化，其中ERK1/2信号通路在这个过程中起重要作用，为进一步了解机械应力的生物转导和治疗骨质疏松的药物靶点开发奠定基础。
三磷酸腺苷不仅是体内能量的直接应用形式，同时也是重要的信号分子，它可以作用于嘌呤受体和激活某些信号通路来发挥信号因子的作用。目前国内外报道的有关三磷酸腺苷对成骨的影响结果不一。例如：Orriss等^[21-23]报道成骨细胞释放的三磷酸腺苷是抑制骨矿化的重要因素；Hoebertz等^[24]报道低浓度的三磷酸腺苷和UTP显著抑制成骨细胞的骨生成。相反，Sun等^[25]报道冲击波通过刺激人骨髓间充质干细胞释放三磷酸腺苷来促进其成骨分化；Ciciarello等^[26]报道三磷酸腺苷抑制人骨髓间充质干细胞增殖并促进其成骨分化；Kariya等^[27]报道压应力使成骨细胞释放三磷酸腺苷并促进其成骨分化，与之相同，本实验发现10，50，250 μmol/L三磷酸腺苷均有促进骨髓间充质干细胞成骨的效应，并且对细胞的增殖均没有影响，其中250 μmol/L浓度的促成骨效应最大。作者分析文献中的矛盾结果可能由很多因素导致，比如实验中使用了不同的细胞系、采用了不同的成骨诱导方法和时间、检测的成骨指标不同等，以上任何一种原因均可能会对实验结果产生影响。有文献报道促进骨髓间充质干细胞成骨分化的因子同时也会抑制其成脂分化，反之亦然^[7-12]。本实验同时检测了三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响，实验结果显示三磷酸腺苷抑制PPARγ，FABP4和Adipsin等成脂相关基因表达，并抑制脂滴生成。Omatsu-kanbe等^[28]报道三磷酸腺苷可增加3T3-L1前脂肪细胞对成脂相关激素的敏感性，而其本身并不影响3T3-L1前脂肪细胞成脂分化，而Ciciarello等^[26]报道三磷酸腺苷促进人间充质干细胞成脂分化和脂滴形成。以上这些报道与本实验的结果并不相同，作者认为实验方法的不同可能是导致实验结果不相符的主要原因：首先，本实验使用的是大鼠骨髓间充质干细胞，而以上2篇文献使用的分别是小鼠的3T3-L1细胞和人骨髓间充质干细胞；其次，Ciciarello等实验中三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞刺激仅1次，且时间只有24 h；最后，Omatsu-kanbe等在实验中使用的三磷酸腺苷的浓度是1-100 μmol/L，Ciciarello等在实验中使用的三磷酸腺苷浓度为1 000 μmol/L，本实验使用的三磷酸腺苷浓度为10-250 μmol/L。以上这些实验方法的差异均可导致不同的实验结果。事实上，三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的作用会受到很多因素的影响，比如细胞自身分泌的三磷酸腺苷、细胞外的核苷酸酶及细胞表面的嘌呤受体的表达等。有文献表明成骨细胞、破骨细胞和骨细胞均会持续的分泌三磷酸腺苷^[29-31]，分泌的三磷酸腺苷会迅速的被细胞表面的核苷酸酶分解为ADP、AMP和Pi^[32]，同时三磷酸腺苷及其水解物均可作用于细胞表面的嘌呤受体并激活下游通路产生一系列生物效应^[33]。不同细胞表面表达的嘌呤受体及核苷酸酶的不同均有可能对三磷酸腺苷产生影响。本实验并没有研究这些影响因素，因此下一步的研究重点将集中在嘌呤受体及核苷酸酶对骨髓间充质干细胞的影响。文献报道ERK1/2信号通路在骨髓间充质干细胞的增殖和分化中起重要作用^[34-40]，实验结果显示三磷酸腺苷在刺激骨髓间充质干细胞5 min后即可激活ERK1/2，并一直持续到60 min。U0126可以阻止三磷酸腺苷对ERK1/2的激活，同时也抑制了三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞的促成骨抑成脂效应，但是U0126并不能完全阻止这种效应。骨髓间充质干细胞的分化有许多调控因素，例如骨形态发生蛋白、转化生长因子β、Wnts通路、胰岛素样生长因子、纤维素样生长因子、甲状旁腺激素、胰岛素及糖皮质激素等^[41-42]。因此，作者推测ERK1/2通路可能只是骨髓间充质干细胞分化的复杂调控网络中的一环，在以后的骨髓间充质干细胞分化调控研究中，仍需要研究更多的信号通路。

三磷酸腺苷对骨髓间充质干细胞成骨和成脂分化的影响

Regulating osteogenic and adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by extracellular adenosine triphosphate

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