组织工程技术修复关节软骨：如何构建新型复合模式？

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.29.028

摘要/Abstract

摘要：

背景：关节软骨缺损自我修复能力有限，传统手段难以修复，关节软骨组织工程为修复大面积关节软骨缺损提供了崭新的方法和途径。

目的：综述组织工程技术修复关节软骨的现状、问题及前景。

方法：检索PubMed数据库1982至2015相关文献，以“Articular cartilage，repair，tissue engineering”为检索词进行检索。纳入与关节软骨组织工程修复相关的文献，排除重复性研究。根据纳入标准，排除无关联或重复的文献，最终保留39篇文献进行综述。

结果与结论：优良的种子细胞具有软骨细胞分化潜能，目前用于关节软骨修复的种子细胞主要有间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪源干细胞及前软骨干细胞等4大类。生长因子趋向于联合应用，生长因子具有诱导宿主实质细胞在体内生长，提高种植的细胞稳定性，加快组织再生的作用。复合支架材料有利于促进细胞接种和细胞的空间分布，促进细胞增殖，是研究的热点。如何优化种子细胞、支架材料和细胞因子的选择和匹配，建立新型复合模式，以获得最佳的关节软骨修复效果，是未来的重要发展方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 组织构建, 软骨组织工程, 关节软骨, 组织工程学, 干细胞, 支架, 细胞因子, 修复, 河北省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Articular cartilage has limited ability to repair itself, and the traditional means are difficult to repair articular cartilage defects, but articular cartilage tissue engineering provides new methods and approaches for large-area articular cartilage defects.

OBJECTIVE: To review the current status, problems and prospects of tissue engineering technology in articular cartilage repair.

METHODS: The retrieval of PubMed database was performed for articles published from 1982 to 2015, with the keywords of “articular cartilage, repair, tissue engineering” in English. Literatures related to tissue engineering repair of articular cartilage were included, but repetitive studies were excluded. Finally 39 articles were reserved in result analysis.

RESULTS AND CONCLUSION: Excellent seed cells have chondrogenic differentiation potential, and currently, the main seed cells for articular cartilage repair include mesenchymal stem cells, embryonic stem cells, adipose-derived stem cells and precartilaginous stem cells. Different growth factors, which can induce the in vivo growth of host parenchymal cells, improve seeded cell stability, and accelerate tissue regeneration, tend to be combined in clinical application. Composite scaffolds are also one of hot researches that can promote cell inoculation and spatial distribution as well as accelerate cell proliferation. To obtain the best effectiveness of articular cartilage repair, how to optimize seed cells, select and match scaffold materials to construct new types of composite patterns is an important direction in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Cartilage, Articular;, Stem Cells, Stents, Cytokines

中图分类号:

R318

杨瑞涛，宋会平. 组织工程技术修复关节软骨：如何构建新型复合模式？[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(29): 4736-4741.

Yang Rui-tao, Song Hui-ping. Tissue engineering technology for articular cartilage repair: how to construct a new compound pattern? [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(29): 4736-4741.

图/表（结果） 1

2.1 纳入文献基本情况共纳入39篇文献，其中引出关节软骨组织工程的必要性4篇^[1-4]，关于种子细胞12篇^[5-16]，关于生物支架材料11篇^[17-27]，关于生长因子8篇^[28-35]，涉及关节软骨组织工程学新型复合模式3篇^[36-38]。

2.2 文献证据综合提炼

2.2.1 种子细胞关节软骨组织工程修复的核心是种子细胞。目前用于关节软骨修复的种子细胞主要有间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪源干细胞及前软骨干细胞等4大类。

间充质干细胞是来源于中胚层的多能祖细胞，可来自人体的各种组织，包括骨髓间充质干细胞，脐带血，肌肉组织，脂肪组织。来自人类脂肪组织的间充质干细胞成功分化成有功能的成白色或棕色脂肪细胞以及神经、肌肉、肌腱、骨、软骨细胞。间充质干细胞存在于骨髓、软骨膜、骨膜等组织，可多向分化，在不同条件下可分化成软骨细胞、成骨细胞、成纤维细胞等，用于病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞常作为软骨组织移植的种子细胞，用以修复关节软骨缺损，有利于组织工程软骨增殖和分化。Baqhaban等^[5]和Bornes等^[6]提出间充质干细胞移植是关节软骨组织工程修复的一种好方法，研究发现间充质干细胞能够治疗膝关节和踝关节创伤性软骨缺损，且广泛应用于关节软骨修复。骨髓间充质干细胞首次由Fridenshte?n^[7]发现。骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在体内或体外特定条件诱导下，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞和骨髓基质。此外，骨髓间充质干细胞在连续传代和冻存后仍保持多向分化潜能，因此是较理想的种子细胞^[8]。

Zhu等^[9]认为骨髓间充质干细胞作为种子细胞在体外构建组织工程化软骨是可行的。结果表明，极少量骨髓经体外扩增即可获得足够数量的关节软骨组织工程用种子细胞，可满足临床用量。骨髓间充质干细胞可分化为软骨细胞并在体内形成软骨组织，缺陷是由于取材困难并且给患者带来较大痛苦，因此临床应用受限。

脂肪源干细胞可以诱导分化成软骨、骨、脂肪、肌肉等。脂肪源干细胞相对于骨髓间充质干细胞优势在于，在获取时给患者带来的痛苦较少，且容易取材，细胞增殖较快^[10]。研究发现脂肪源干细胞是治疗关节软骨缺损的一条新路径，脂肪源干细胞直接注入骨关节炎关节治疗关节软骨缺损^[10]，可向软骨细胞分化。
将脂肪源干细胞的注入病变关节，可促进透明软骨再生以治疗骨关节炎。由于其更好的生物利用度和容易大量取材，脂肪源干细胞的功能研究，包括软骨细胞分化及体内研究，已经引起关节软骨组织工程领域的极大兴趣。

胚胎干细胞是从早期胚胎中分离出来的一类细胞，胚胎干细胞是种子细胞领域中的一个重要的新资源，其主要的缺点是在移植后存在形成肿瘤的风险。替代的方法是使用多谱系限制的祖细胞，将不形成畸胎瘤^[11]。Toh等^[12]将由人胚胎干细胞分化而来的软骨细胞用于裸鼠体内关节软骨缺损修复。结果表明，胚胎干细胞植入体内12周后，关节软骨缺损处可见高度有序排列的软骨组织，软骨结构具有透明质酸样软骨层、软骨表面结构完整且与相邻自然骨结合完好，修复后再生的软骨组织与未经修复的自然软骨组织相似。但由于受伦理等问题的影响，胚胎干细胞在临床应用中受限。

Wu等^[13]提出前软骨干细胞是关节软骨组织工程的良好种子细胞，低能量620 nm红光照射诱导前软骨干细胞向软骨细胞分化，研究发现该波长的红光促进其细胞外基质分泌并诱导其向软骨细胞分化。

Nejadnik等^[14]提出多能干细胞能修复关节透明软骨，人诱导多能干细胞向软骨细胞分化模式图见图1。最近，使用病毒独立编程技术从脂肪干细胞或成纤维细胞产生的人自体诱导多能干细胞^[15-16]，已被引入用于创建特定患者的软骨生成，作为临床应用的来源。与同种异体细胞不同，自体诱导多能干细胞不产生免疫反应；与胚胎干细胞不同的是其不存在伦理问题，已成为可供选择的新型细胞来源。

2.2.2 生物支架材料支架材料在关节软骨组织工程的实现起着至关重要的作用。一种多样性的生物支架具有独特的生化、生物力学和形态学特性。不同的特性可被用于制造特异性的支架用于组织工程器官^[17]。理想支架材料具有以下条件^[17]：无毒、无免疫排斥、组织相容性高；生物支架材料降解时间适宜；生物力学特性好；可塑性高；可用性强。生物支架材料应用于关节软骨的主要有天然支架、合成支架、纳米支架和复合支架材料等4类^[18]。复合支架材料、纳米材料等新型材料的研究是目前研究的重要热点领域之一。

复合支架材料有利于促进细胞接种和细胞的空间分布，促进细胞增殖。研究发现PLGA/胶原复合材料显著提高软骨细胞的增殖和软骨基质的分泌，是软骨-骨界面组织缺损修复的良好支架材料^[19]。Yan等^[20]提出脱细胞的软骨细胞外基质合成材料(聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸)具有良好的生物相容性和力学强度，可诱导关节软骨再生。

研究发现软骨细胞外基质在体内可诱导间充质干细胞分化成软骨细胞。Stocco等^[21]发现聚乙烯醇与细胞外基质新型复合支架材料，优势在于体内、体外都较单一支架更好诱导软骨形成并促进软骨细胞的黏附，可提供适宜软骨细胞生长的仿生微环境。Wang等^[22]研究发现具有低渗透性不完全隔离双层支架材料可用于关节软骨组织工程。这种双层结构在植入过程中可以提供良好的初始稳定性和较好的机械支持，体外研究表明，高通透性支架增强骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化，而低渗透性支架利于软骨细胞生长。

近几年，纳米技术尤其是纳米支架材料的应用研究明显加快了组织工程学发展。Liu等^[23]研究发现3D纳米纤维结构对诱导多能干细胞作用是，可诱导体外培养的软骨细胞和影响非负重区关节软骨缺损修复。结果显示，培养的纳米纤维支架增强诱导多能干细胞的生长和分化。此外，诱导多能干细胞种子支架移植到软骨缺损区，修复效果优于单纯支架移植。

Chaudhury等^[24]认为当电纺纳米纤维掺入到纤维支架，使该支架模仿天然细胞外基质，从而维持在无血清的条件下细胞构成。这增强了糖胺聚糖在支架上的沉积，进而证明其是促进软骨再生的一种有效方法。

生成的支架类似于在体内软骨细胞的形成，蛋白质和肽纳米纤维结合后引起糖胺聚糖沉积，随后形成软骨组织。结果表明在组织工程学中纳米技术的应用彻底改变了移植/支架系统的传统应用，使细胞和组织的再生性能的设计显著增强；但缺陷是这个领域还处于起步阶段，纳米水平的细胞生物材料相互作用的机制还不是很清楚，在临床应用之前，还需对这些纳米材料的功用和毒性效应有更详细的研究。

Lim等^[25]提出将纳米技术应用于软骨组织工程可生产仿生软骨再生支架。纳米支架材料有较高的表面积与体积比，可促进蛋白质的吸附和配体的结合，这意味着存在一些结合位点和定向功能，更好的呈现了细胞受体和具有天然细胞外基质的功能在支架生产的仿生学重要意义。

石墨烯(Graphene，G)是一种具有特殊的理化性能和机械性能的纳米生物材料，它被越来越多地开发用于药物递送和组织工程应用中。Gu等^[26]发现G的对骨再生的作用机制，G提高植入物或支架材料的力学和生物学性能的能力，如镍钛合金和碳纳米管，并能促进种子细胞黏附、增殖。G在体内具有生物相容性，G对骨分化又有促进能力。Lee等^[27]最近研究发现纳米G材料与间充质干细胞复合体外培养可促进间充质干细胞软骨分化，G微粒为软骨组织的形成和成熟充当“成长因子工厂”，这种新合成的细胞组装复合材料为软骨组织工程构建提供了新途径。

2.2.3 细胞因子关节软骨细胞的增殖、分化和自我更新过程离不开生长因子的作用。生长因子决定功能化的关节软骨的定向分化，生长因子诱导宿主实质细胞在体内生长，提高种植的细胞稳定性，加快组织再生^[28]。研究发现能够调控关节软骨修复作用的生长因子主要有转化生长因子β、成纤维生长因子、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白^[28]。

转化生长因子β广泛存在于各种组织中，在软骨组织工程中，转化生长因子β是目前软骨损伤修复的主要生长因子。研究表明该联合应用较单一因子的效果更好，可构建无支架的新生软骨。Murphy等^[29]发现转化生长因子β1、骨形态发生蛋白2β和GDF-5联合应用可诱导软骨形成，刺激人关节软骨细胞和骨髓间充质干细胞增殖。

利用转化生长因子β与其他诱导因子基因联合，目前这种转染种子细胞方法是关节软骨组织工程学一个研究方向，可发挥多基因诱导的协同作用。Frisch等^[30]提出转化生长因子β可能通过重组腺相关病毒(rAAV)载体介导的基因转移促进人间充质干细胞向软骨细胞分化，结果表明转化生长因子β可促进人间充质干细胞分化为软骨细胞治疗关节软骨缺损。Rocha等^[31]发现转化生长因子β可有效诱导并促进脂肪源干细胞向软骨细胞分化，定向分化和增殖能力更加优于脂肪源干细胞的单独作用。

骨形态发生蛋白增加软骨细胞基质的合成，提高软骨修复效率，有研究表明其促进作用显著，可促使细胞向软骨细胞表型方向分化。Karl等^[32]提出成熟关节软骨细胞经转化生长因子β和碱性成纤维细胞生长因子联合诱导培养可形成再生软骨祖细胞，其用于构建自体源性工程组织，完成关节软骨缺修复损。Jiang等^[33]提出在诱导间充质干细胞向软骨细胞分化时骨形态发生蛋白4比骨形态发生蛋白7效率更高。且诱导的软骨细胞，在数量及形态上与自然软骨类似。这些特性使得骨形态发生蛋白成为近些年的研究热点。

胰岛素样生长因子可促进成软骨种子细胞增殖，还可刺激软骨细胞Ⅱ型胶原的合成并维持软骨细胞生长。转化生长因子β3/骨形态发生蛋白2联合基因应用于软骨组织工程，通过转染骨髓间充质干细胞诱导其成软骨细胞分化，联合基因转染效率较单基因转染效率高^[34]。研究发现关节腔内注射转化生长因子β1可促进软骨基质的分泌及软骨细胞再生，有望用于研发成为延缓骨性关节炎发病进程的新型药物。富血小板血浆富含多种生长因子，当由激动剂如凝血酶激活，富血小板血浆释放包括血小板衍生的生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、纤连蛋白和胰岛素样生长因子1等，已经被成功用于骨性关节炎，以促进软骨修复^[35]。

2.2.4 关节软骨组织工程学新型复合模式生物反应器可模拟体内微环境、可运输营养物质供细胞生长、可形成细胞生长所需的力学刺激。与细胞复合培养时，对提高组织工程关节软骨的力学特性有益。利用灌注生物反应器三维培养模式，可促进细胞的黏附、生长和分化，减少细胞之间的接触抑制^[36]。

Man等^[37]研究发现同轴电纺支架含有骨髓间充质干细胞特异性亲和肽(E7)和重组人转化生长因子β1(CbrhTE)。基于同轴静电纺丝技术，CBrhTE支架不仅可以提高骨髓间充质干细胞的黏附和生长，而且提高了软骨细胞分化的潜能，还可同步提高软骨组织工程所需的3个基本组成部分。因此，CBrhTE支架的发展为设计和建立更高效的修复软骨组织的特殊支架铺平了道路。Zhu等^[38]发现使用骨髓间充质干细胞与PGA高密度聚丙烯支架构建软骨是可行的，解决了临床使用工程软骨的一些阻碍，如体积有限、形变和数量有、种子细胞等问题。研究表明，软骨细胞培养基中转化生长因子α能够上调α-SMA的表达；而聚乙烯具有足够的机械强度以承受由成软骨诱导产生的收缩力，并维持原有的形状和大小。

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