人肺鳞癌干细胞的体外分离培养和鉴定

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (28): 4526-4530.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.018

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人肺鳞癌干细胞的体外分离培养和鉴定

刘哲亮¹，邬娇²，王林纤³，陈跃军¹，吴冠宇¹，肖高明¹

中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院，¹胸外一科，²麻醉科，³检验科，湖南省长沙市 410013

出版日期:2015-07-02 发布日期:2015-07-02
通讯作者: 肖高明，博士生导师，主任医师，中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院/湖南省肿瘤医院胸外一科，湖南省长沙市 410013
作者简介:刘哲亮，男，1979 年生，湖南省祁东县人，汉族，2010 年中南大学湘雅医学院毕业，博士，主治医生，主要从事肺癌临床和肺癌干细胞基础研究。
基金资助:
湖南省自然科学基金资助项目(14JJ7092)；湖南省卫生厅科研计划项目(C2013-027)

In vitro isolation, culture and identification of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma

Liu Zhe-liang¹, Wu Jiao², Wang Lin-xian³, Chen Yue-jun¹, Wu Guan-yu¹, Xiao Gao-ming¹

¹First Department of Thoracic Surgery, ²Department of Anesthesiology, ³Department of Laboratory, the Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China

Online:2015-07-02 Published:2015-07-02
Contact: Xiao Gao-ming, Doctoral supervisor, Chief physician, First Department of Thoracic Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
About author:Liu Zhe-liang, M.D., Attending physician, First Department of Thoracic Surgery, the Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410013, Hunan Province, China
Supported by:
the Natural Science Foundation of Hunan Province, No. 14JJ7092; the Scientific Research Plan of Hunan Health Department, No. C2013-027

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究显示可从肺癌细胞系中分离出肺癌干细胞，但对于从新鲜肺鳞癌标本中原代培养肺癌干细胞的报道较少。
目的：探索从新鲜肺鳞癌组织标本中分离肺鳞癌干细胞的可行方法。
方法：借助胶原酶消化法、密度梯度离心法和Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞，将初筛细胞置于条件培养基分离培养，后续应用流式细胞分析及分选技术，进一步分离纯化肺鳞癌干细胞。实验结合CD133和CD44鉴定目标细胞，并计数第4代细胞CD133+、CD44+及CD133/CD44双阳性细胞的阳性率。
结果与结论：接种后0.5 h细胞贴壁生长，培养第4天形成典型的细胞集落，第7天呈铺路石样外观，细胞数量级可达108。传代培养第4代肺癌干细胞的CD133+、CD44+和CD133/CD44双阳性细胞数明显增多。说明实验初步从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并快速扩增SP细胞，并从中获取更多更纯的干细胞样肺鳞癌细胞，为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺鳞癌, 肺癌干细胞, 原代培养, 细胞鉴定, 表型, 诱导分化, 流式细胞术, 湖南省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that lung cancer stem cells can be isolated from lung cancer cell lines. But there are few reports about in vitro isolation, culture and identification of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma.

OBJECTIVE: To explore the feasible methods of harvesting lung cancer stem cells from fresh lung cancer tissue in patients with lung squamous carcinoma.

METHODS: Side population cells were isolated by collagenase digestion, Ficoll density gradient centrifugation and Hoechst 33342 solution. The isolated cells were suspended in conditioned medium for isolated culture. Flow cytometry method was used to detect lung cancer stem cells based on the cell surface markers CD133 and CD44, and the positive rates of CD133⁺, CD44⁺ and CD133⁺/CD44⁺ cells were recorded.

RESULTS AND CONCLUSION: Cells adhered at 0.5 hour after incubation; typical cell colony was formed at 4 days of culture; cells showed paving stone-shape at 7 days in a total number of 10⁸. The positive rates of CD133⁺, CD44⁺ and CD133⁺/CD44⁺ cells at passage 4 were increased significantly. These findings indicate that stem

cell-like lung cancer cells were obtained from fresh lung cancer tissue in patients with lung squamous carcinoma, which were stably and rapidly amplified in vitro, laying the foundation for the further study on the heterogeneity and resistance of lung cancer stem cells in the future.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Lung Neoplasms, Neoplastic Stem Cells;, Phenotype, Cell Separation, Flow Cytometry

中图分类号:

R394

刘哲亮，邬娇，王林纤，陈跃军，吴冠宇，肖高明. 人肺鳞癌干细胞的体外分离培养和鉴定[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4526-4530.

Liu Zhe-liang1 Wu Jiao, Wang Lin-xian, Chen Yue-jun, Wu Guan-yu, Xiao Gao-ming. In vitro isolation, culture and identification of lung cancer stem cells in patients with lung squamous carcinoma[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4526-4530.

图/表（结果） 1

2.1 SP细胞分选结果外排Hoechst33342染料是SP细胞的重要特征，也是初筛肺癌干细胞的重要依据^[15]。实验通过流式细胞仪分步分选SP细胞，即除杂、选取单个细胞、保留活细胞、获取SP细胞(图1)。流式分选结果显示，经密度梯度离心处理得到的待测样本中，细胞成分占68.5%；单个细胞占细胞成分的79.3%、占总样本的54.3%；活细胞占单个细胞的82.1%，占总样本的44.6%；SP细胞占活细胞的7.8%，占总样本的3.5%。

2.2 体外培养的肺癌干细胞形态学特征通过流式细胞仪分选的SP细胞接种0.5 h后即可贴壁生长，形状大小均一，分布均匀；24 h后可见数个细胞集落萌发，见图2A；第4天有多个典型细胞集落形成，集落中心为大量圆形细胞成堆生长，周围有纺锤形或梭状细胞呈放射状分布，单个集落的细胞总数大于50，见图2B；第7天由集落发散的细胞多数处于增殖阶段，细胞相互接触，呈铺路石样外观，数量级可达108，其间散在少量细胞增殖集落，见图2C。

2.3 干细胞标记物鉴定

2.3.1 免疫荧光检测结果第4代细胞培养10 d后，在贴壁细胞中可见PE-CD133/FITC-CD44双阳性细胞，其中PE标记CD133抗体荧光染色呈红色，见图3A；FITC标记CD44抗体呈绿色荧光，见图3B；CD133/CD44双阳性细胞呈黄色荧光，是分离纯化的肺癌干细胞，见图3C，上述空白对照荧光抗体均呈阴性。200倍视野下CD133，CD44和CD133/CD44阳性细胞数量分别为(42.8±2.2)，(129.3± 5.4)，(28.8±9.8)个。

2.3.2 流式细胞术检测结果细胞培养第10天行流式细胞术检测，结果提示传代培养第4代肺癌干细胞的CD133、CD44和CD133/CD44双阳性细胞数明显增多(图4)；流式细胞检测结果显示，第4代CD133，CD44和CD133/CD44阳性细胞表达率分别为(14.07±3.51)%，(42.94±4.91)%和(9.59±0.79)%。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察。

时间及地点：实验于2014年8月至2015年3月在中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院完成。

材料：

分离肺癌干细胞使用的主要试剂与仪器：
试剂及仪器	来源
RPMI 1640培养基，优质胎牛血清，青霉素/链霉素，Ⅱ型胶原酶，重组人表皮生长因子，重组人碱性成纤维细胞生长因子，DMEM培养基	美国Gibco公司
Hoechst33342，PI染料，曲那通溶液	美国Sigma公司
人Fc受体封闭剂，小鼠抗人CD133-PE单克隆抗体及其同型对照抗体小鼠IgGI-PE	德国Miltenyi公司
小鼠抗人CD44- FITC单克隆抗体及其同型对照抗体小鼠IgGI-FITC	美国BD Bioseien公司
生物素化抗小鼠IgG，SABC免疫组化试剂盒，浓缩DAB试剂盒	德国Vector公司
ACS Aria^TM Ⅱ型流式细胞分选仪	美国Becton and Dickinson公司
LSM510激光共聚焦显微镜	德国Zeiss公司
倒置相差显微镜Eelipse TE30和荧光显微镜 EclipseE60	日本Nikon公司

选取2014年8月至2015年3月中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院收治肺鳞癌患者40例，男33例，女7例，年龄41-73岁，平均(58.5±0.5)岁。病理分期以肺癌TNM分期(第7版)为依据^[12]，ⅠA期3例，ⅠB期5例，ⅡA期16例，ⅡB期13例，ⅢA期1例，ⅢB期2例。按《医院管理条例》第33 条规定对患者的治疗及风险进行如实告知，患者家属对治疗均签署知情同意书，治疗方案经中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院医学伦理委员会批准。

方法：

肺癌干细胞原代细胞培养及建系方法：

肺癌组织处理：参照Ho等^[13]的方法，并加以改进：新鲜手术切除的肺癌组织，经快速病检证实为鳞癌，60 min内行细胞分离实验。用含1×10⁵ U/L氨苄青霉素、100 g/L硫酸链霉素的DMEM反复冲洗并剔除坏死组织，用无菌剪刀反复剪切成约1 mm³大小的组织块。用含有Ⅱ型胶原酶4×10⁵ U/L的DMEM无血清培养基在体积分数为5%的CO₂培养箱中37 ℃震荡孵育消化4 h，通过100 μm细胞滤器。用70%/40%的密度梯度离心液重悬，于25 ℃以2 500 r/min离心20 min得单细胞悬液。

Hoechst33342染料外排法初筛SP细胞(side population cells)：参照Golebiewska等^[14]的方法，将上述得到的单个细胞用DMEM(添加体积分数2%胎牛血清、10 mmol/L的HEPES)缓冲液调整细胞浓度为1×10⁹ L^-¹，加入10 mg/L浓度的PI染料，于37 ℃震荡孵育30 min，预冷的Hanks溶液洗涤细胞，4 ℃低温离心后得单细胞悬液，流式细胞仪分选有活力细胞；再加入5 mg/L浓度的Hoechst33342染料，于37 ℃震荡孵育90 min，预冷的Hanks溶液洗涤细胞，4 ℃低温离心后得单细胞悬液，流式细胞仪分选SP细胞用于后续实验。

细胞培养：上述分选的SP细胞用DMEM培养基(添加体积分数10%胎牛血清，20 μg/L人表皮生长因子，20 μg/L人碱性成纤维细胞生长因子)，在含体积分数为5%的CO₂培养箱中37 ℃培养，每3 d换新鲜培养基1次。当细胞生长到80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化后传代。培养的前4代细胞在传代时每次都保留部分细胞冻存于液氮中，备用于后续实验。

人肺鳞癌组织来源肺癌干细胞鉴定及计数：

流式细胞仪分选及纯化肺癌干细胞：为减少系统误差，本部分试验只选取16例ⅡA期患者的肺癌标本为研究对象。应用流式细胞分析及分选技术寻找CD133⁺/CD44⁺的肺癌干细胞。细胞传代培养4代后，取对数生长期的肺癌细胞，收集消化后的单个细胞，体积分数10%胎牛血清/PBS洗涤2次，调细胞浓度为3×10¹⁰ L^-¹，加入Fc受体封闭剂，4 ℃避光反应10 min。取上述细胞分别加入CD133-PE和CD44-FITC抗体，另取上述细胞同时加入CD133-PE和CD44-FITC抗体，将上述细胞在冰盒里避光孵育30 min，最后用体积分数10%胎牛血清/PBS洗涤2次。用1 mL的含体积分数10%胎牛血清的PBS悬浮细胞，过40 μm的无菌筛网，放置冰上待分析分选。在同样的条件下标记同型对照抗体细胞组。应用FACSAriaⅡ流式细胞仪分析分选CD133⁺、CD44⁺及CD133/CD44双阳性细胞。将从第4代细胞中分选纯化的CD133/CD44双阳性细胞用于传代培养建立肺癌干细胞细胞系。

免疫荧光染色检测：取第4代细胞培养10 d后爬片，纯丙酮固定，0.5%曲那通破膜，Fc受体封闭剂孵育10 min，后续分别用PE标记CD133抗体孵育10 min，FITC标记CD44抗体孵育30 min，各步均4℃避光反应，激光共聚焦显微镜观察阳性细胞，于200倍显微镜随机观测15个视野并拍照计数，结果取平均值。

主要观察指标：①SP细胞分选结果。②肺鳞癌干细胞形态观察。③免疫荧光鉴定结果。④流式细胞仪分选及鉴定结果。

统计学分析：所有数据采用SPSS 11.5软件包进行分析。计量资料以x(_)±s表示。

讨论

白血病干细胞是首个表明肿瘤干细胞存在的实验证据^[16]。对乳腺癌研究中第一次证实实体肿瘤起源自干细胞^[17]。Ho等^[13]首次发现利用Hoechst染料外排法分离的SP细胞，具有与干细胞相似的特性。SP细胞分选技术还广泛运用于从多种组织中分选干、祖细胞，这些组织来源包括脐带血、骨骼肌、肾脏、肝脏、乳腺和脑组织^[18-23]。

实验采用CD133和CD44作为鉴定肺鳞癌来源肺癌干细胞的分子标记。CD133是一种细胞表面的糖蛋白，由5个跨膜结构域和两个大的糖基化的胞外环构成，可用于肺癌干细胞的鉴定^[24]。CD133及其糖基化抗原决定簇AC133已被用于正常人体造血干细胞、神经干细胞、肺癌、脑癌、结肠癌和胰腺癌干细胞的分选^[25-27]。研究发现小细胞肺癌和非小细胞肺癌组织中都存在CD133⁺肺癌干细胞，表明CD133可作为肺癌干细胞广义的表面标志物^[28]。CD44是细胞表面的一种跨膜糖蛋白，参与细胞黏附、增殖、生长、转移等^[29]，且与恶性肿瘤的发生、发展有关，可能是肺鳞癌干细胞的标志物^[30]。本实验结合肺癌干细胞广义的表面标志物CD133和肺鳞癌干细胞标志物CD44，目的在于尽量提高肺鳞癌干细胞分选和鉴定的准确性。流式分选结果提示，从新鲜肺鳞癌组织中分离的肺癌干细胞，进行传代培养到第4代时，CD133阳性率为(14.07±3.51)%，CD44阳性率为(42.94±4.91)%，CD133/CD44双阳性细胞所占比例为(9.59±0.79)%。

目前肿瘤干细胞模型已经获得广泛认可，肺癌干细胞与肿瘤侵袭、转移性进展、抵抗治疗和癌症复发密切相关^[31]。由于肺癌的组织学亚型不同，导致肺癌干细胞的异质性存在差异^[32]，从而难以确定肺癌特异性干细胞标志物^[33]。本实验从肺鳞癌患者新鲜肺组织标本中分离培养并获取干细胞样肺鳞癌细胞，且在体外稳定快速扩增，这将为进一步研究肺鳞癌干细胞的异质性和耐药性奠定基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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