同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨支架材料修复尺骨缺损：CT扫描及组织学检测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.017

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞具有来源广泛、含量丰富、容易获取，培养条件简单且扩增能力强等优点，有可能成为继骨髓间充质干细胞之后最具前景的骨组织工程种子细胞。

目的：探讨兔脂肪干细胞与脱钙骨支架材料复合修复尺骨缺损的可行性。

方法：构建兔尺骨缺损动物模型，将单纯脱钙骨材料植入右侧缺损区，设为对照组，将成骨诱导后的兔脂肪干细胞-脱钙骨支架材料复合物植入左侧缺损区，设为实验组。植入后12周，获取骨缺损处组织标本进行CT扫描和组织学检测。

结果与结论：经CT扫描，实验组骨缺损断端与材料的接合部位已不能清晰分辨，断端外侧可观察到平行骨痂。对照组脱钙骨未完全降解，可观察到清晰的骨断端，未观察到连续骨痂，骨缺损处大多为纤维连接，未出现骨性修复。经组织学检测，实验组缺损处为典型再生骨组织，存在骨细胞和骨陷窝以及骨小梁结构，骨细胞和骨陷窝数量较多，仅有部分骨小梁结构形成，并有少量胶原样结构穿插于再生骨组织之间；对照组有脱钙骨基质残留现象，并存在部分胶原纤维样组织，在边缘可观察到一定的骨膜成骨反应，但程度较轻，且未出现大片再生骨样组织。以上结果表明兔脂肪干细胞成骨诱导后与脱钙骨支架材料复合可以用于修复尺骨缺损。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 尺骨缺损, 动物模型, 骨修复, 同种异体, 脱钙骨

Abstract:

BACKGROUND: Adipose-derived stem cells have a wide variety of sources and strong proliferation ability, which are easy to access and simple to culture. Therefore, adipose-derived stem cells that are secondary to bone marrow mesenchymal stem cells are expected to become the most promising seed cells for bone tissue engineering.

OBJECTIVE: To explore the feasibility of rabbit adipose-derived stem cells with demineralized bone matrix to repair ulna defects.

METHODS: Ulna defect model was made in rabbits. Demineralized bone matrix was implanted into the right defect region as control group. After osteogenic induction, rabbit adipose-derived stem cells/demineralized bone matrix composite was implanted into the left defect region as experimental group. At 12 weeks after implantation, defect tissues were taken for CT scanning and histological detection.

RESULTS AND CONCLUSION: CT results showed that there was unclear boundary between the broken ends of fractured bone and the composite material in the experimental group, and parallel calluses out of the broken end could be seen. In the control group, the broken end was clearly seen and no callus occurred continuously. Fibers were connected at the defect site, and no new bone occurred. Histological findings showed that typical regenerated bone tissues were seen in the experimental group with osteocytes, bone lacunae and bone trabeculae; there were more osteocytes and bone lacunae, but bone trabecula was only seen in a part of bone defects; a few of collagens interlarded the regenerated bone tissues. In the control group, the residual of demineralized bone matrix was seen as well as some collagenous fibers, and periosteal bone formed a little, but no large amount of regenerated osteoid tissues were found. These findings indicate that under osteogenic induction, rabbit adipose-derived stem cells combined with demineralized bone matrix are feasible to repair ulna defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Stem Cells, Adipose Tissue, Tissue Scaffolds, Ulna

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 兔脂肪干细胞形态接种24 h后细胞逐渐由组织团块中爬出，分散贴壁生长，开始多为圆形，部分细胞成星形、多角形等多种形态，色深(图2A)。48 h后细胞已基本完全贴壁，细胞分布均匀，呈小多角形或者短梭形，有时可见到较多的突起(图2B)。换液两三次可完全筛除未贴壁的细胞，贴壁细胞逐渐伸展为梭形，随着细胞数量增加，形态变为长梭形，呈成纤维细胞样改变(图2C)。5-7 d细胞大量增殖，呈成簇分布，排列有方向性，可呈漩涡状生长。传代后细胞倍增时间变快，呈相对均一梭形成纤维样细胞(图2D)。

2.2 兔脂肪干细胞鉴定第2-5代兔脂肪干细胞经免疫组化染色后显示，超过90%的细胞CD29、CD44和CD105呈阳性表达，而不表达CD34、CD45及HLA-DR，见图3。

2.3 兔脂肪干细胞在脱钙骨材料上的生长情况兔脂肪干细胞接种于脱钙骨材料3 d进行扫描电镜观察，可见细胞分布在材料边缘，并呈弥散状态；接种7 d，可见大部分材料表面均覆盖有细胞，且密集度高，见图4。

2.4 兔脂肪干细胞-脱钙骨材料成骨表型检测结果诱导组的碱性磷酸酶水平在4 d起开始增加，之后逐渐上升，并于14 d达到最大值，之后水平逐渐下降(图5A)。随着时间的推移，成骨诱导组兔脂肪干细胞-脱钙骨材料的钙离子分泌水平不断上升(图5B)，而非诱导组碱性磷酸酶表达与钙离子分泌均保持在相对较低的水平，较之诱导组差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 实验动物数量分析选择6只新西兰大白兔进行造模，全部进入结果分析。
2.6 CT检测结果经CT扫描可见，植入材料未出现明显的降解，但植入成骨诱导兔脂肪干细胞-脱钙骨材料复合物的一侧已经无法对骨缺损断端与材料的接合部位予以清晰的分辨，断端外侧可观察到平行骨痂(图6A，B)。单纯植入脱钙骨材料一侧脱钙骨未完全降解，可观察到清晰的骨断端，未观察到连续骨痂。骨缺损处大多为纤维连接，未出现骨性修复(图6C，D)。
2.7 组织学检测结果材料植入12周时，经组织学检测，实验侧缺损处为典型再生骨组织，存在骨细胞和骨陷窝以及骨小梁结构，但骨细胞和骨陷窝数量较多，骨小梁结构仅有部分形成，并有胶原样结构穿插于再生骨组织之间，但数量较少(图7A，B)；对照侧可观察到脱钙骨基质残留现象，并存在部分胶原纤维样组织，在边缘可观察到一定的骨膜成骨反应，但程度较轻，且未出现大片再生骨样组织(图7C，D)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2015年2至6月在泸州医学院附属医院实验室完成。

材料：

实验动物：健康新西兰大白兔8只，雌雄不限，二三个月龄，体质量2.0-2.5 kg，购买自上海斯莱克实验动物有限责任公司。使用动物品种品系规格、处死动物的方法等均符合动物伦理学要求。

支架材料：实验所用的支架材料为猪脱钙骨，取新鲜猪干骨中段进行常规脱脂、脱钙等处理后获得。对猪脱钙骨进行修剪，得到近似圆柱体，呈多孔网状结构，尺寸为 5 mm×5 mm×15 mm。猪脱钙骨外形大体情况见图1。

同种异体脂肪干细胞修复尺骨缺损实验所用试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
LG-DMEM培养基	上海西宝生物科技有限公司
Ⅰ型胶原酶	上海恒远生物科技有限公司
ascorbate-2-phosphate	湖北拓楚慷元医药化工有限公司
1,25-dihydroxyvitamin D3	上海佰世凯化学科技有限公司
β-glycerophosphate	上海桥杜生物科技有限公司
茜素红	上海复蒙基因生物科技有限公司
钙离子检测试剂盒	上海士锋生物科技有限公司
CO₂培养箱	北京五洲东方科技发展有限公司
倒置相差显微镜	长沙长锦科技有限公司
离心机	北京兴达恒信科技有限公司
酶标仪	北京中豪莱伯科技发展有限公司
恒温摇床	北京金业德祥科技有限公司
扫描电镜	北京博劢行仪器有限公司
荧光显微镜	上海纳锘实业有限公司

实验方法：

脂肪干细胞分离培养：对2只新西兰大白兔进行麻醉后，于无菌条件下，切取两肩胛骨内侧缘脂肪组织进行原代培养和传代培养。PBS反复冲洗脂肪组织3遍，无菌条件下，剔除组织中筋膜和小血管，PBS洗3遍，去除表面血细胞。剪碎脂肪组织，Ⅰ型胶原酶消化60 min。以等体积含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液终止消化，离心后弃去上清液，获得高密度间质组织细胞团，并以红细胞裂解液处理5 min，除去掺杂的红细胞，再过直径100 μm的筛网，除去未完全消化的组织。所获得的细胞用生长培养液重悬，以4×10⁴/cm²接种于培养皿中，并置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、100%湿度条件下培养，24 h后第1次换液，之后每周换液2次。当细胞长至70%-80%融合状态时，以1︰3的比例传代，选用第3-5代细胞进行免疫表型的鉴定。

脂肪干细胞与脱钙骨材料的复合：收获第3代兔脂肪干细胞制备细胞悬液，采用反复滴加的方法，使细胞均匀分布于支架材料上。

细胞在材料表面的黏附和细胞外基质的分泌情况：第3代兔脂肪干细胞以3×10⁸ L^-1细胞浓度接种于5 mm×5 mm× 3 mm大小的脱钙骨材料上，放置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱孵育4 h后加入GM培养液，第2天换成骨诱导液(生长培养液，0.01 μmol/L 1，25-dihydroxyvitamin D3，50 μmol/L ascorbate- 2-phosphate，10 mmol/L β-glycerophosphate)。分别于接种 3，7 d后收集细胞-材料复合物，用扫描电镜观察兔脂肪干细胞在脱钙骨材料表面的黏附和细胞外基质分泌情况。

碱性磷酸酶含量以及细胞外钙盐沉积定量检测：第3代兔脂肪干细胞以 3×10⁸ L^-¹细胞浓度接种于5 mm×5 mm× 3 mm大小的脱钙骨材料上，放置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的细胞培养箱孵育4 h后加入GM培养液，第2天换成骨诱导液(生长培养液，0.01 μmol/L 1,25-dihydroxyvitamin D3，50 μmol/L ascorbate- 2-phosphate，10 mmol/L β-glycerophosphate)。以生长培养液作为对照组，分别于接种 4，7，14，21，28 d后检测碱性磷酸酶活性和钙盐沉积情况。

兔尺骨缺损模型制备：对6只新西兰大白兔行全身麻醉，取尺骨中段纵形切口，逐层切开显露尺骨，于尺骨中段以线剪人为造成15 mm长度骨缺损，剔除两断端附近的骨膜。造模后即刻将单纯脱钙骨材料植入右侧缺损区，设为对照组；将诱导后的兔脂肪干细胞-脱钙骨支架材料复合物植入左侧缺损区，设为实验组。

CT扫描和组织学检测：术后12周，处死动物，获得组织标本，包括动物双侧前肢肘关节处修复骨及其周围软组织。锯下的前肢行三维CT扫描，根据三维重建的结果来评价骨缺损的修复情况。大体观察标本并记录后用体积分数为10%的甲醛溶液固定24 h，放置于20%甲酸溶液中进行脱钙，每隔3 d更换1次脱钙液，脱钙完成的标准为针刺易穿入即可。标本流水冲洗过夜，经脱水，透明，浸蜡及包埋，制成石蜡标本。石蜡标本切片厚度为5 µm行苏木精-伊红染色。

主要观察指标：兔脂肪干细胞在脱钙骨材料上的生长情况，兔脂肪干细胞-脱钙骨材料成骨表型鉴定，动物体内植入材料降解情况和组织学检测结果。

统计学分析：数据用x(_)±s表示，利用SPSS 17.0软件进行处理，进行独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨骼生长和愈合的能力是极其有限的，如果骨折、骨肿瘤造成大段骨缺损，需要进行修复治疗^[8-9]，骨组织工程的快速发展，为其治疗提供了新方法^[10-15]。种子细胞是组织工程骨构建和应用研究中的首要环节和基本要素，其中应用较多的种子细胞为骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞具备以下4个特征：①具有一定的成骨潜能，细胞中的成纤维细胞可通过集落方式形成一定的单位，并通过分化形成骨系细胞^[16-17]。在诱导条件下可使其向成骨细胞系分化，表现出成骨潜能^[18]。②来源广泛，取材方便，对机体损伤小^[18-21]。③骨髓间充质干细胞易于分离培养，并且体外增殖快^[22-24]。研究表明，骨髓间充质干细胞在体外连续培养20-30个细胞周期后仍可保持较强的增殖能力^[25]。④骨髓间充质干细胞经连续传代仍具有稳定的成骨潜能^[26-28]。但是，由于骨髓间充

质干细胞的提取是一个有创的过程，而且其增殖和分化受到年龄的限制，实际获取骨髓间充质干细胞的数量较少，因此，临床予以大批量应用难度较大^[29-30]。

脂肪干细胞起源于中胚层，具有强大的多向分化能力，是一种特殊的定居于脂肪组织中的干细胞^[31-34]。在一定的诱导条件下，脂肪干细胞可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、神经元细胞等^[35-37]。而且，较之骨髓间充质干细胞，脂肪干细胞获取难度较小，且获得率高，因此具有十分明显的应用优势^[38-39]。从脂肪中获取的脂肪干细胞，还可以实现同种异体移植^[40]。本次研究结果显示，兔脂肪干细胞接种于脱钙骨材料3 d进行扫描电镜观察，可见细胞分布在材料边缘，并呈弥散状态；7 d时可见大部分材料表面均覆盖有细胞，且密集度高。成骨诱导后碱性磷酸酶水平在4 d起开始增加，之后逐渐上升，并于14 d达到最大值，之后水平逐渐下降。随着时间的推移，兔脂肪干细胞-脱钙骨材料在钙离子分泌水平方面表现出不断上升的情况，表明处于支架材料上的细胞有很强的成骨分化潜能。经CT扫描和组织学检测，可以发现植入兔脂肪干细胞-脱钙骨材料复合物的一侧已经无法对骨缺损断端与材料的接合部位予以清晰的分辨，缺损处为典型再生骨组织。但是，受研究时间的限制，同种异体脂肪干细胞修复尺骨缺损的长期效果未予以相应的观察和分析。

综上，脂肪干细胞在脱钙骨材料上可以很好的增殖，经诱导可以向成骨细胞分化；同种异体脂肪干细胞复合脱钙骨生物支架材料可以成功修复兔尺骨缺损，提示脂肪干细胞可以成为骨组织工程临床应用的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程