脂肪干细胞在人工骨支架诱导下的成骨效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：种子细胞的来源不足是限制组织重建及再生医学发展的重要因素。

目的：探索脂肪干细胞与不同种类人工骨混合后的诱导成骨效果。

方法：从接受美容手术的女性志愿者腹部皮下抽取液状脂肪，分离脂肪干细胞。取第4代人脂肪间充质干细胞分为单纯成骨诱导液组、成骨诱导液+羟基磷灰石组、成骨诱导液+可吸收骨材料组、成骨诱导液+重组异种骨组。后3组分别加入羟基磷灰石生物陶瓷、可吸收骨材料和重组异种骨，且每组依据干预物浓度的差异分为3，10，20 g/L 3个亚组，每3 d换液1次．共进行12 d的诱导。

结果与结论：成骨诱导液+羟基磷灰石组的洗脱液钙浓度显著高于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)；低浓度条件下成骨诱导液+可吸收骨材料组洗脱液钙浓度明显高于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)，但高浓度成骨诱导液+可吸收骨材料组洗脱液钙浓度与单纯成骨诱导液组差异无显著性意义(P > 0.05)；成骨诱导液+重组异种骨组洗脱液钙浓度显著低于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)。表明不同类型人工骨支架可以影响脂肪干细胞诱导成骨效果，其中以羟基磷灰石为支架可以获得较好的诱导成骨效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 成骨效果, 种子细胞, 骨生物材料支架, 人工骨, 羟基磷灰石, 可吸收骨材料, 重组异种骨

Abstract:

BACKGROUND: Insufficient source of seed cells is the important factor to restrict the tissue reconstruction and the development of regenerative medicine.

OBJECTIVE: To explore the osteogenesis of adipose stem cells cultured with different kinds of artificial bones.

METHODS: Adipose tissue was extracted from female volunteers undergoing cosmetic surgery to isolate adipose stem cells. Passage 4 adipose-derived mesenchymal stem cells were selected and divided into osteogenic induction group, osteogenic induction+hydroxyapatite group, osteogenic induction+absorbable bone group and osteogenic induction+recombinant bone xenograft group. The latter three groups were subdivided into 3, 10,

20 g/L subgroups, respectively. Culture medium was exchanged every 3 days, totally for 12 days.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the osteogenic induction group, the calcium concentration in the elution liquid was significantly higher in the osteogenic induction+hydroxyapatite group and low-concentration osteogenic induction+absorbable bone group (both P < 0.05), but no difference was found between the osteogenic induction group and high-concentration osteogenic induction+absorbable bone group (P < 0.05). In addition, the calcium concentration in the elution liquid was significantly lower in the osteogenic induction+ recombinant bone xenograft group than the osteogenic induction (P < 0.05). Therefore, different artificial bone scaffolds can influence the osteogenic effect of adipose stem cells, and among them, hydroxyapatite has a better effect on the osteogenic induction of adipose stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Scaffolds, Subcutaneous Fat, Stem Cells, Hydroxyapatites

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：观察性实验。

时间及地点：实验于2015年4至5月在内江市第二人民医院完成。
材料：

脂肪干细胞与不同种类人工骨混合后的诱导成骨实验使用的主要试剂和仪器：
材料和仪器	来源
茜素红指示剂	南京森贝伽生物科技有限公司
成人脂肪间质干细胞完全培养液	北京泰泽嘉业科技发展有限公司
胰酶	上海瑞齐生物科技有限公司
PBS	赛业(广州)生物科技有限公司
Na₂HPO₄	上迈巨科生物科技有限公司
磷酸钙骨水泥	广州市安杰生物技术有限公司
成人脂肪间质干细胞成骨诱导培养液	上海一研生物科技有限公司
流式细胞仪	贝克曼库尔特有限公司
超净工作台	武汉金志飞净化设备有限公司
CO₂培养箱	郑州宏朗仪器设备有限公司
冰箱	安徽省美歌电器有限公司
离心机	陕西鑫昌实验仪器设备有限公司
显微镜	上海仪圆光学仪器有限公司
水平摇床	创博环球(北京)生物科技有限公司

脂肪由10名接受美容手术的女性志愿者提供，年龄29-40岁，平均(33.25±5.15)岁，一般情况良好，并均对本次研究相关具体内容知情。从10名志愿者腹部皮下抽取液状脂肪，保存备用。本次研究相关内容和方法均经内江市第二人民医院伦理部门审核并批准，实验设计方案和伦理问题等均符合要求。

羟基磷灰石生物陶瓷由石家庄科兴新技术产品有限公司提供，产品分子式：Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，由羟基磷灰石组成，产品标准：YY0305《羟基磷灰石生物陶瓷》。

重组异种骨由天津中津生物发展有限公司提供，产品由去抗原牛骨与高效成骨诱导因子-牛骨形态发生蛋白重组而成，产品标准：Q/12 XJ 3867-1999《重组合异种骨(金世植骨灵)》。

可吸收骨材料由北京美康成科技有限公司提供，产品是从牛骨中提取的纯无机盐材料产品标准：进口产品注册标准 YZB/SWI 1826-2008《可吸收骨材料》。

方法：

脂肪干细胞的取材和培养：取出脂肪样品，吸去下层水相层，并将其置于离心管中，每管25 mL进行离心。离心结束将上层浮油层和下层水相层吸取，并加入等体积PBS进行漂洗，再次离心，离心结束吸去下层水相。加入等体积的Ⅰ型胶原酶溶液，充分震荡摇匀并加盖，利用封口膜进行封口处理。对离心管进行37 ℃水浴，反应30 min后取出进行离心。离心结束用吸去水相上清层和上层油层。将培养基重悬细胞集中到离心管中，离心后弃去上清。对培养液重悬细胞进行接种，每3 d换液1次，待细胞80%-90%融合时进行传代培养。

人工骨诱导成骨实验：对第4代人脂肪间充质干细胞进行复苏和传代，待细胞融合率达到80%时进行消化接种，接种到六孔板中。针对脂肪干细胞特异性白细胞表面抗原CD105、CD44以及非特异性白细胞表面抗原CD34、CD L4、CD45，同时取2×10⁶个细胞，利用流式细胞仪进行测定(数据未显示)。于无菌环境下，将可吸收骨材料、羟基磷灰石生物陶瓷、重组异种骨研磨成细粉，并加入人脂肪干细胞成骨诱导培养液中，质量浓度分别为3，10，20 g/L。待六孔板中细胞融合率达到80%之后，将单纯成骨诱导液以及含有不同浓度、不同人工骨的成骨诱导液加入其中，并进行分组。一共分为4组：单纯成骨诱导液组、成骨诱导液+羟基磷灰石组、成骨诱导液+可吸收骨材料组、成骨诱导液+重组异种骨组。每组设3个复孔，每3 d换液1次，共进行12 d的诱导。

成骨后染色鉴定：诱导结束后吸去诱导液，利用PBS对每个孔进行洗涤，每孔加入1 mL中性甲醛并置于室温条件下进行固定。固定结束利用PBS对每各孔进行洗涤，洗涤结束向各孔加入1 mL茜素红染色液，置于室温条件下进行染色。染色结束吸去染色液，加入PBS进行洗，最后加入1 mL PBS，显微镜观察。

成骨后染色定量分析：利用Na₂HPO₄配制磷酸钙骨水泥，并洗脱茜素红。置于室温条件下利用摇床进行40 min轻摇，吸取洗脱液，利用用酶标仪对洗脱液562 nm处的吸光度值进行测定。

主要观察指标：脂肪干细胞成骨诱导变化。

统计学分析：数据以平均值表示。对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，并进行方差分析和多重比较。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

受到外伤和疾病等诸多因素的影响，导致骨缺损患者数量的不断上升^[9]。临床对骨缺损患者进行治疗的时候大多需要进行骨移植，以往大多采用自体骨移植等方式，但在骨需求量等方面受到一定的限制^[10-15]。

组织工程是近年来研究最热门的新兴学科，其首要因素是种子细胞^[16-19]。脂肪干细胞是存在于脂肪组织中的具有向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等多向分化能力的细胞，具有与骨髓间充质干细胞相似的特性^[20-25]。在不同的诱导条件下向不同的组织细胞分化，且拥有来源充足、取材容易、获得率高、体外增殖能力强等优势，被认为是最有可能用于临床的种子细胞之一^[26-30]。随着脂肪干细胞研究的不断发展，为临床骨移植提供了新的思路^[33-36]。细胞在分化过程中往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称为干细胞^[37]。一旦需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞^[38-42]。按分化潜能的大小，干细胞基本上可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞3类^[43]。干细胞能生成骨骼、肌肉、神经等各种组织和脏器，在再生医疗中，利用胚胎干细胞、骨髓干细胞生成骨髓的方法正处于研究阶段，利用患者的骨髓干细胞也相当困难^[44-47]。而从脂肪中提取干细胞不仅原料丰富，而且能有效回避伦理质疑，避免移植产生的排异反应，减轻患者生理负担^[48-50]。在治疗患者骨骼组织的时候，由于是根据患者自身的脂肪干细胞培养出的，因而不会造成排异反应，也不存在传播疾病的风险^[51-53]。在本实验中，即以此为基础，将人脂肪干细胞与不同种类的人工骨进行混合，并对其具体的成骨效果进行比较和分析。实验抽取接受美容手术的健康女性的皮下液状脂肪进行研究，通过提纯和分离获得研究所需的脂肪干细胞。并利用流式细胞仪检对所得肪干细胞进行检测，了解其表面特异性抗原，从而保证所得为脂肪干细胞^[54]。研究过程中，将脂肪干细胞与3种不同浓度不同类型的人工骨诱导液进行混合培养，分为单纯成骨诱导液组和成骨诱导液组+羟基磷灰石组、成骨诱导液+可吸收骨材料组、成骨诱导液+重组异种骨组。诱导成骨结束后进行染色鉴定和染色定量分析，了解脂肪干细胞成骨诱导后茜素红染色情况以及脂肪肝细胞成骨诱导定量分析结果。最终的研究结果显示，骨诱导液+羟基磷灰石组的洗脱液钙浓度数据均显著高于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)，即表明，利用不同人工骨为支架进行脂肪干细胞诱导成骨可以达到较之单纯诱导培养更好的效果。研究结果还显示，低浓度条件下成骨诱导液+可吸收骨材料组的钙浓度值明显高于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)，高浓度条件下差异无显著性意义(P > 0.05)。

提示在低浓度条件下，其对应的结构和形状可以为脂肪干细胞提供更好的环境，达到更好的生长和成骨诱导效果。而研究结果还显示，成骨诱导液+重组异种骨组的钙浓度值均显著低于单纯成骨诱导液组(P < 0.05)。且在添加诱导液之后，不同浓度细胞均处于较差的生长状态，出现严重的死亡、脱落现象，细胞和人工骨之间结合能力差。表明含有骨诱导形成蛋白人工骨和细胞的结合能力差，此种人工骨无法促进成骨作用。分析出现这一情况的原因，可能是因为在骨诱导形成蛋白和脂肪干细胞表面可能存在一定的受体结合部位，因而对脂肪干细胞的甚至和成骨诱导等产生一定的影响导致的^[55-56]。另外，通过比较可以发现，以不同类型人工骨为支架进行脂肪干细胞诱导成骨，以羟基磷灰石为支架可以获得较好的效果。分析出现这一结果的原因，可能的受到羟基磷灰石支架特殊结构的影响，在进行培养的时候，干细胞能够在支架中保留、生长，微小的孔洞也有利于细胞生长过程中的营养交换^[57-59]。但受到入组样本数量以及观察时间等因素的影响，实验结果可能存在一定的片面性和不准确。
综上所述，利用可吸收骨材料和重组异种骨、羟基磷灰石人工骨为支架进行脂肪干细胞诱导成骨可以达到较之单纯诱导培养更好的效果，其中，以羟基磷灰石为支架可以获得较好的效果。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程