尿酸对人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中Wnt信号通路的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：尿酸作为一种内源性的抗氧化剂，其抗氧化、抗DNA 损害作用及发挥促成骨作用近年受到关注。

目的：探讨不同浓度尿酸对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin 信号通路相关基因表达的影响。

方法：采用全骨髓贴壁法体外分离培养健康成年人骨髓间充质干细胞，培养至第3代时，用含不同浓度尿酸(0，140，280，560 μmol/L)的成骨诱导液进行成骨向诱导分化培养，检测细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性、增殖能力以及Wnt信号通路中Wnt-3α，β-catenin mRNA的表达。

结果与结论：各组细胞碱性磷酸酶染色为阳性，尿酸干预后各组细胞碱性磷酸酶活性和增殖能力增高，Wnt信号通路相关基因Wnt-3a、β-catenin的表达上调，且呈现浓度依赖性，各指标在实验组与对照组间比较以及实验组组间比较，差异均有显著性意义(P < 0.05)。结果显示尿酸可通过促进Wnt-3a/β-catenin信号通路进而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖和分化，具有浓度依赖性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 尿酸, 人骨髓间充质干细胞, 成骨分化, Wnt信号通路

Abstract:

BACKGROUND: Uric acid, as an endogenous antioxidant, exhibits anti-oxidative and anti-DNA damage effects, promotes osteogenic differentiation, and therefore has been paid more attentions.

OBJECTIVE: To investigate the effects of different concentrations of uric acid on the expression of genes related to Wnt/β-catenin signaling pathways during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Healthy adult human bone marrow mesenchymal stem cells were in vitro isolatedby adherent culture of whole bone marrow. Passage 3 bone marrow mesenchymal stem cells were induced to differentiate into osteoblasts using different concentrations of uric acid (0, 140, 280, 560 μmol/L). Alkaline phosphatase activity, cell proliferation capacity, and Wnt-3α and β-catenin mRNA expression in the Wnt signaling pathways were detected.

RESULTS AND CONCLUSION: Alkaline phosphatase staining was positive. After treatment with uric acid, alkaline phosphatase activity and cell proliferation capacity were increased, the expression of Wnt signaling pathway-related genes Wnt-3a and β-catenin was up-regulated in a dose-dependent manner. There were significant differences in the abovementioned indices between experimental groups and between each experimental group and control group (P < 0.05). These findings suggest that uric acid up-regulates Wnt-3a/β-catenin signaling pathway and thereby promotes the osteogenic differentiation and proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells in a dose-dependent manner.

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中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是一类非造血干细胞，来源丰富，自我更新能力和体外增殖能力强，易于分离培养。骨髓间充质干细胞在进行自体移植方面具有安全、无致瘤性、无组织配型和免疫排斥的问题，探索其体外扩增及定向分化的条件是目前的重要研究热点^[1-3]。骨髓间充质干细胞可以分化为骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肝细胞，甚至神经元细胞^[4-5]，为结缔组织等相关疾病中的骨、软骨、肌腱等损伤修复提供了潜在的细胞来源，被认为是骨组织工程中有价值的种子细胞。

尿酸是一种pH为5.75的弱有机酸，在生理pH条件下多以尿酸盐的形式存在。在人类及猿类动物中尿酸是嘌呤的代谢产物，由于人类进化过程中基因的突变导致编码这类酶的基因缺乏，使人类体内尿酸水平远高于其他哺乳动物。正是有了尿酸的强抗氧化作用，人类的寿命才显著高于其他多种哺乳动物^[6]。尿酸在体内含量远远超过维生素C、维生素E或谷胱苷肽，可部分代替维生素C、维生素E抗氧化功能，又是体内内源性的产物，在生理pH范围内能有效发挥作用^[7]。

Wnt信号通路调控着许多生命过程，包括生物体的生长、发育、疾病、衰老和死亡，是胚胎及器官发育的主要信号转导途径之一。Wnt信号通路包括Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路，Wnt/Ca²⁺信号通路，Wnt/PCP(平面细胞极性)信号通路等^[8-9]。经典的Wnt/β-catenin 信号通路在成骨细胞生成和骨形成等方面扮演重要的角色^[10-13]。当Wnt 蛋白与Fizzled 受体的7次跨膜区域以及低密度脂蛋白受体相关蛋白5和6(LPR5/6)共受体结合时，Wnt/β-catenin信号通路激活，稳定的β-catenin 转移入核，在核内这个转录共激活子与T细胞因子/淋巴增强结合因子(TCF/LEF)相互作用，最终启动下游成骨相关基因的转录，调控着成骨细胞的分化与成熟功能^[14-17]。

此前的实验中已观察到尿酸可能通过促进Cbfα1/Runx2的表达，从而促进人骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨细胞分化^[18-19]，然而其具体作用机制尚未完全明确。本实验应用尿酸干预诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化，观察尿酸对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt/β-catenin 信号通路相关基因表达的影响，为将来临床治疗骨质疏松症提供一定的实验依据。

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材料方法

设计：细胞学体外实验研究。

时间及地点：实验于2014年7月至2015年2月在青岛大学附属医院黄岛分院科教楼痛风实验室完成。

材料：

骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt信号传导通路中相关基因表达检测所用主要试剂：
试剂	来源
低糖-DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、双抗	Hyclone公司
地塞米松(Dexamethasone)，L-2-磷酸抗坏血酸(L-Ascorbic acid-2-phosphate)，β-甘油磷酸	Sigma公司
钙盐染色液(改良茜素红S法)、碱性磷酸酶染色试剂盒及BCA法蛋白定量试剂盒	南京建成生物工程研究所有限公司
TRITON-X100	Solarbio公司
TRIZOL	Gibco公司
反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒	Tiangen公司
引物	上海生物工程技术服务公司合成

实验方法：

骨髓间充质干细胞的分离和培养：18-55周岁健康志愿者来自于青岛大学医学院附属医院，无菌条件下抽取骨髓2 mL，采用全骨髓贴壁法分离培养，加入完全培养基(含L-DMEM，体积分数为10%胎牛血清，1%双抗)8 mL，吹打混匀制成细胞悬液，接种于25 mL培养瓶中，每瓶约5 mL，第3天半量换液，第6天或第7天全量换液，之后每三四天换液1次，待细胞长至80%-90%时传代，取第3代细胞进行实验。

骨髓间充质干细胞的成骨诱导分化：选取处于对数生长期第3代骨髓间充质干细胞，以细胞浓度2×10⁵ L^-¹接种到6孔无菌细胞培养板，分为4组，每组3个孔，培养2 d后，对照组加入成骨诱导液(含体积分数为10%胎牛血清、1×10^-⁸ mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 g/L抗坏血酸的L-DMEM培养液)培养，实验组分别加入含140，280，560 μmol/L尿酸的成骨诱导液，置37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱，每3 d换液1次，连续诱导14 d，观察细胞的形态学变化。

骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化后碱性磷酸酶染色：取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，接种于6孔板中，各实验组给予不同处理因素后，于第7天按碱性磷酸酶试剂盒说明书操作，进行碱性磷酸酶染色鉴定(用PBS冲洗，固定液固定5 min，加底物后37 ℃作用15 min，水洗，复染10 min，水洗，晒干)，倒置显微镜下观察。

骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化后碱性磷酸酶活性检测：取对数生长期第3代骨髓间充质干细胞，消化制备2×10⁵ L^-¹的细胞悬液接种到12孔无菌细胞培养板中，用含不同浓度尿酸的成骨培养液继续培养7 d，吸掉培养基，PBS冲洗细胞，每孔加入1%Triton-X100裂解液200 μL，裂解细胞40 min，用移液枪吹打收集于1.5 mL离心管中，按照BCA法蛋白定量试剂盒及碱性磷酸酶活性检测试剂盒说明书进行成骨细胞碱性磷酸酶活性检测，分别于562 nm处和520 nm处检测96孔板中各孔吸光度值，按照公式分别计算各组成骨细胞中碱性磷酸酶活力。

细胞碱性磷酸酶活力=(测定吸光度值-空白吸光度值)/(标准吸光度值-空白吸光度值)×酚标准品浓度/待测样本浓度。

CCK-8法检测骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化后增殖能力：取对数生长期第3代骨髓间充质干细胞，消化制备细胞浓度1×10⁴ L^-¹的细胞悬液接种到96孔无菌细胞培养板中，每孔加入100 μL细胞悬液，每组设置3个复孔，于培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后更换培养液，并按照实验设计，实验组加入含不同浓度尿酸的成骨诱导培养液，对照组加入等量成骨诱导培养液，继续放入培养箱内培养，并按时间梯度于第3，7天依次采集细胞，分别在所需检测的培养孔内每孔加10 μL CCK-8，37 ℃继续孵育4 h，测定450 nm处各孔吸光度值。

RT-PCR法检测成骨细胞Wnt信号通路相关基因的表达：各组分别于诱导的第10天采用RT-PCR检测成骨细胞Wnt信号通路相关基因的表达。

总RNA的提取：细胞用PBS冲洗2遍，按6孔板每孔加入1 mL Trizol，充分吹打，将其移到1.5 mL EP管，静置 5 min，然后加入0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，静置3 min；4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，把上层水相转移到新的1.5 mL EP管中；加入0.5 mL异丙醇，混匀，静置5 min；4 ℃、7 500 r/min离心10 min，去上清；用1 mL体积分数75%乙醇洗涤沉淀；4 ℃、7 500 r/min 离心10 min，弃去液体；于超净工作台上鼓风干燥10 min后，加入20 μL无RNase的水，并在260 nm/280 nm下测定其浓度，-80 ℃冻存备用。

反转录合成cDNA：先按照FastQuant RT Kit(with gDNase)说明书配制DNA去除体系的混合液，加入RNA 2 μg，5×gDNA Buffer 2 μL，RNase-Free ddH₂O补足到10 μL，混匀简短离心，并置于42 ℃孵育3 min，置于冰上放置，再配置反转录反应体系：10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，FQ-RT Primer Mix 2 μL，加5 μL RNase-Free ddH₂O补足到10 μL，将反转录体系的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀，42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育3 min之后用于PCR扩增。

所用引物序列：Wnt3a：上游引物5’-CGG GAC TGG AGA AAT GGT C-3’，下游引物5’-ATG AGG CAA CCA GGG ATA TG-3’；β-catenin：上游引物5’-TGG TGA CAG GGA AGA CAT CA-3’，下游引物 5’-CCA TAG TGA AGG CGA ACT GC-3’；内参照GAPDH：上游引物5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，下游引物5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT CT-3’。

PCR扩增的反应体系为25 μL，反应体系包括：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，正向引物0.75 μL，反向引物0.75 μL，cDNA模板11 μL，反应条件：95 ℃、15 min 预变性，95 ℃、10 s变性，55 ℃、30 s退火，72 ℃、32 s延伸，40个循环。

RT-PCR产物鉴定及分析：釆用熔解度曲线法鉴定产物特异性和片段大小，根据扩增产物的Ct值及相对标准曲线求出各标本所含基因的模板量，先计算ΔCt，即各样本测定基因Ct与内参基因GAPDH Ct的差值，再用各实验组样本的ΔCt减去正常对照组样本的ΔCt，得到ΔΔCt，而mRNA的相对表达量以公式2^-^??Ct计算。

主要观察指标：细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶活性、增殖能力以及Wnt信号通路中Wnt3α，β-catenin mRNA的表达。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计分析软件包处理分析数据，实验数据用x(_)±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间比较釆用LSD-t 法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨质疏松症是以骨量减少、骨组织显微结构退化、骨脆性增加、易于发生骨折的一种全身性代谢性疾病，随着中国老年化进程加速，骨质疏松症发病率在不断地增加。目前中国有9 500万人患有骨质疏松症，其发病率已跃居常见病、多发病的第六位^[20-21]，骨质疏松症已经是一个严峻的社会问题。近年来发现，骨髓间充质干细胞与骨质疏松症的发生发展密切相关，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化能力的减弱或向脂肪细胞分化能力的增强是导致骨质疏松症的原因之一^[22-24]。骨髓间充质干细胞的成骨分化是骨形成和骨重建中最重要的一部分，并且受多种局部因子和系统激素的调节，这些因子和激素通过信号通路将信号传递到转录效应器，控制成骨细胞不同分化阶段特异基因的表达，从而控制成骨细胞处于不同的分化阶段。

Wnt蛋白是一系列高度保守的分泌性糖蛋白，目前发现有19种，不同的Wnt蛋白具有独特的分泌方式，在胚胎发育、肿瘤形成过程中具有调节细胞增殖、分化、极性等一系列的功能^[25-28]。近来研究表明，Wnt蛋白及其下游信号通路在间充质干细胞的增殖及分化过程中发挥重要作用。在成骨细胞中，Wnt蛋白作为经典Wnt信号通路的起始因子，能够影响成骨细胞的增殖、分化，其中Wnt-3a分子在成骨细胞分化中发挥重要作用，可以激活CCN1/CYR61基因，从而促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，尤其是对碱性磷酸酶表达的调节^[29-31]。β-catenin是Wnt经典通路中的关键因子，其量的积累是Wnt 经典通路的关键环节。β-catenin是由130个氨基酸残基构成的，细胞质中含量最多，位于Ihh和Osx的下游，通过激活β-catenin-T细胞因子/淋巴增强因子的基因转录，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化、成熟^[32]，从而在调控骨形成中起重要作用，有研究发现，在β-catenin敲除的小鼠中出现间充质细胞前体细胞向软骨细胞发育，皮质骨和松质骨的骨量明显降低，同时促进了破骨细胞的分化，出现骨质疏松^[33-34]。Mbalaviele等^[34]研究结果显示：β-catenin和BMP-2可协同上调骨钙素的基因表达，促进基质矿化及新骨形成，并且Wnt-3a和β-catenin在早期骨再生时期表达增强，可引起下游骨调节因子Runx2表达上调^[35]。

碱性磷酸酶是成骨细胞所分泌的一种酶蛋白，其高表达是成骨细胞分化成熟的早期标志。本实验分别在诱导后的第7天，对尿酸组和对照组细胞进行碱性磷酸酶活性测定，发现碱性磷酸酶活性随尿酸浓度增加而增强，并且尿酸组碱性磷酸酶活性均明显高于对照组。碱性磷酸酶染色阳性被认为是成骨细胞的特异征象，是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的标志之一。通过碱性磷酸酶染色亦观察到，尿酸组在细胞群连接紧密、聚集成团的区域最早出现阳性表达，染色也较深，细胞最早开始向成骨细胞分化且随着尿酸浓度的增加染色加深。细胞形态学观察与碱性磷酸酶活性测定的生化结果相一致。同时，CCK-8法检测结果表明，一定浓度范围内尿酸能促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化增殖，其中 560 μmol/L尿酸作用最明显，亦呈现出浓度依赖性，RT-PCR检测成骨细胞的Wnt-3a、β-catenin mRNA结果亦显示，随着尿酸浓度增加，Wnt-3a、β-catenin基因表达增强，并存在浓度依赖性。

综上所述，尿酸可通过促进Wnt/β-catenin信号通路Wnt-3a、β-catenin基因的表达促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。由此可见，Wnt /β-catenin信号通路的激活可能是尿酸促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要机制之一。

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