异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：异种生物衍生骨保存了原骨组织的天然网状孔隙结构，且具有免疫原性低、细胞相容性好的特点。

目的：验证异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞的生物相容性。

方法：取新鲜猪股骨制备生物衍生骨，扫描电镜观察材料结构。将第3代兔骨髓间充质干细胞以2×10⁹ L^-¹的浓度接种于生物衍生骨材料的松质骨面，复合培养7 d内，采用扫描电镜观察细胞生长情况；复合培养8 d内，计数材料上附着的细胞数。

结果与结论：生物衍生骨表面粗糙，孔隙不规则并相互通联，构成网状结构。复合培养3 d，细胞在衍生骨材料表面发生附着，且细胞形态不均一；复合培养培养 5 d，细胞连接成片呈层状生长，细胞之间紧密接触；复合培养7 d，细胞呈现多层生长状态，成堆生长，部分区域存在细胞外基质分泌现象。复合培养后，前2 d 为潜伏适应期，3-6 d细胞生长呈出线性曲线，处于细胞生长对数期；第 6 天后，细胞生长曲线逐渐变得平缓，细胞增殖速度下降，增殖进入平台期。表明异种生物衍生骨材料与骨髓间充质干细胞具有良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 生物衍生骨材料, 骨髓间充质干细胞, 细胞毒性, 生物相容性, 复合培养

Abstract:

BACKGROUND: Bio-derived xenograft bone has natural pore structure of the bone, low immunogenicity, and good cytocompatibility.

OBJECTIVE: To verify the biocompatibility of bio-derived xenograft bone with bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Fresh pig femoral bone was collected to prepare bio-derived bone. Scanning electron microscope was used to observe the material structure. Passage 3 rabbit bone marrow mesenchymal stem cells at a density of 2×10⁹/L were inoculated into the cancellous bone surface of the bio-dervied bone and cultured for 7 days. Cell growth was detected using scanning electron microscope. After culture for 8 days, cell number was counted.

RESULTS AND CONCLUSION: The bio-derived bone had rough surface and irregularly interconnected pores constructing a mesh-like structure. After 3 days of compound culture, cells had irregular shapes and adhered to the surface of bio-derived bone; after 5 days of culture, cells were closely interconnected to form a layered growth; after 7 days of culture, cells exhibited multilayered growth and the extracellular matrix secreted locally. Under compound culture, the former 2 days were latent period, 3-6 days were logarithmic phase, and from the 6^th day, the cell growth curve became smooth gradually and the cell proliferation decreased and entered into the plateau period. These findings indicate that the bio-derived xenograft bone has good biocompatibility with bone marrow mesenchymal stem cells.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Biocompatible Materials, Stem Cells, Bone Marrow

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

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引言

长期以来，由于肿瘤切除和创伤等原因导致的各种类型骨缺损一直是临床治疗的难点^[1-2]。为了治疗骨缺损，需要进行骨移植修复^[3]，但在供体骨来源方面存在严重不足的难题。使用患者自体骨进行修复，虽然可以达到较好的骨修复效果，但对患者造成了新的创伤，且来源十分有限^[4-9]；而实施异体、异种骨移植需要考虑免疫排斥反应问题。近年来，临床开始积极研制各种生物材料用来进行骨缺损修复^[10]。目前组织工程提供了一个新的途径，运用组织工程的方法，以支架材料为载体，复合分离的种子细胞，在体外预先构建有生命的种植体，植入体内以修复组织缺损，替代后重建器官结构，维持改善组织器官功能。各种生物材料的出现很好地解决了供体骨来源问题，但其细胞毒性及生物相容性是不容忽视的问题^[11-13]。在体外条件下，骨髓间充质干细胞具有很强的增殖能力，具备多向分化潜能，是骨组织工程理想种子细胞^[14]。在构建组织工程骨的过程中，细胞与材料的黏附是基础，只有种子细胞与材料发生适当地黏附，才能进一步发生增殖和分化。然而，细胞与材料的黏附作用受材料含水量、材料表面理化性质、材料表面改性处理、材料表面几何性质、表面特化结构等因素的影响。因此，在具体的实验过程中，应选择适当的细胞外基质作为组织工程骨支架材料。理想的支架材料必须要有具备如下特点：具有良好的三维立体多孔结构；吸收动力学与新的骨组织形成速率匹配，使局部负荷逐渐过渡到新生骨组织；材料降解产物应无毒且容易被机体排出，具有良好骨传导及骨诱导作用，生物相容性好；与宿主骨有相似的机械性能，能与其之间形成稳定的界面，局部不易诱发形成瘢痕组织；可以耐受国际标准要求的临床骨支架灭菌方法；能够制备与缺损组织形态相似的形态。生物衍生骨材料是一种特殊的生物材料，具有网状孔隙结构，可以很好地保持原骨组织特点^[15-16]。生物衍生骨经冷冻、脱脂、去细胞、去抗原和去蛋白等程序处理，保存了原骨组织的天然网状孔隙结构，保留一定的成骨诱导因子，并且其主要成分为胶原，具有免疫原性低、细胞相容性好的特点。以生物衍生骨为载体，复合骨髓间充质干细胞，可以在体外环境下构建具有有生命活力的种植体，将其植入体内可以修复组织缺损。本次实验过程中制备生物衍生骨，将其与兔骨髓间充质干细胞进行体外复合培养，观察复合培养效果，以探讨异种生物衍生骨材料的细胞毒性及其与骨髓间充质干细胞的生物相容性。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：单一样本观察性实验。

时间及地点：于2015年3至4月在上海交通大学附属上海市第一人民医院完成。

材料：

实验动物：4周龄纯种新西兰大白兔1只，由泉州市蓝图生物科技有限公司提供，健康状况良好，体质量1.5 kg。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中涉及动物福利和伦理问题等均符合要求。

异种生物衍生骨材料生物相容性实验的仪器和试剂：
仪器和试剂	生产厂家
培养箱	上海飞越实验仪器有限公司
超净工作台	上海森信实验仪器有限公司
倒置显微镜	南京贝帝实验仪器有限公司
离心机	长沙维尔康湘鹰离心机有限公司
扫描电镜	复纳科学仪器(上海)有限公司
低糖DMEM培养基	武汉博士德生物工程有限公司
胎牛血清	北京拜尔迪生物技术有限公司
0.25%胰蛋白酶	北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司
冰箱	安徽中科都菱商用电器股份有限公司
3%戊巴比妥钠	北京普博斯生物科技有限公司
磷酸盐缓冲液	友康基业生物科技(北京)有限公司
环氧乙烷	河南省三强医疗器械有限责任公司

实验方法：

制备生物衍生骨：取新鲜普通家猪股骨，仅保留松质骨，剔除关节软骨和周围软组织、骨膜，制成骨条，大小为1 cm×0.4 cm×0.3 cm。对骨条进行处理，制作生物衍生骨，处理方法包括脱蛋白、脱脂、脱钙等。采用酸碱法脱钙、脱蛋白，利用氯仿/甲醇作为溶剂进行脱脂，氯仿/甲醇体积比为1∶1，取氯仿及甲醇各25 mL，将预处理后的猪骨样本置于其中，于阴暗处密封放置，浸泡24 h后取出骨样，用蒸馏水反复冲洗干净，然后置于电热鼓风干燥箱中50 ℃干燥24 h，完成氯仿/甲醇脱脂过程。处理完毕置于-80 ℃深低温冰箱中保存，48 h 后取出，经环氧乙烷消毒后置于-4 ℃环境下备用。并取部分骨支架利用扫描电镜进行观察，了解其支架形态。
兔骨髓间充质干细胞分离培养与鉴定：经耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠对兔进行全身麻醉，于双侧股骨近端及胫骨近端进行骨穿，获得4.0-5.0 mL骨髓。获得骨髓血后立即利用等量磷酸盐缓冲液进行洗涤，离心后弃去上清液。重复操作2 次，接种于 50 mL 培养瓶中并置于培养箱中进行培养，培养条件为37 ℃、体积分数5%CO₂。连续培养3 d 后换液，去除悬浮细胞。待原代培养细胞生长达到瓶底面积80%-90%时，添加0.25%胰蛋白酶进行2.0-3.0 min的消化，并添加含血清的DMEM培养基对消化进行终止。终止后进行离心，弃去上清液，并按照1∶3进行接种。利用流式细胞仪对第3代细胞进行检测，细胞均能稳定阳性表达细胞表面抗原，不表达白细胞共同抗原CD45及造血系标志物CD34和CD133，表明所得细胞为骨髓间充质干细胞。
细胞与支架复合培养：利用胰蛋白酶对第3代骨髓间充质干细胞在无菌条件下进行吹打，获得单细胞悬液，并调整细胞浓度为2×10⁹ L^-¹。对生物衍生骨材料进行预湿处理，取250 μL细胞悬液滴入生物衍生骨材料的松质骨面，待充分渗入后进行4 h的预培养。培养结束后加入含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM培养基中进行复合培养，隔日换液，利用电镜和倒置显微镜进行观察。检测细胞增殖情况：对异种生物衍生骨进行处理，并取24块按照上述方法接种骨髓间充质干细胞。接种24 h 后，取3块复合物利用磷酸盐缓冲液进行冲洗，使未贴壁细胞脱落，并利用0.25%胰酶进行消化，对材料上附着的细胞数予以计算。之后8 d，每天均取3块材料进行细胞计数。
主要观察指标：生物衍生骨材料的外观和结构；兔骨髓间充质干细胞在生物衍生骨上的生长、增殖情况。

讨论

各种生物材料的出现很好地解决了供体骨来源问题。生物医学材料的分类方法比较多^[17]，其中可以按照材料性质的不同进行分类，或者按照材料来源进行分类，还可以按照材料在人体中的部位进行划分。按照材料的性质分类是比较主流的分类方法，可以将生物医学材料分为金属材料、高分子材料、医用陶瓷、复合材料、生物衍生材料、可降解材料及组织工程支架材料等。

生物组织经过处理后获得的材料称为生物衍生材料^[18-20]。来源于人体的生物衍生材料保留了正常的网架结构，组织相容性好，是较为理想的组织工程支架材料^[21-24]，如胶原凝胶、脱细胞真皮构建组织工程皮肤，纤维蛋白凝胶构建组织工程软骨等^[25]。生物衍生材料也可以成为生物再生材料，是由天然生物组织经过处理而形成的，比如牛心包膜制作的人工心脏瓣膜和脑膜等^[26-29]。生物衍生材料取自于生物体内，经过加工后用于人体组织和器官的修复，这种生物源性材料最大的优势在于经过适当的处理，具有很好的生物相容性，这种材料在实际应用中，在某些领域已出现了取代传统生物医学材料的趋势^[30]。生物衍生材料的原料直接取自于动物，所以具有良好的生物兼容性，是未来生物医学材料发展的方向之一。

李彦林等^[31]利用不同处理方法制备出不同的生物衍生骨支架材料，并采用体外实验的方式分析不同生物衍生骨的体外细胞相容性。研究发现，经显微镜、扫描电镜观察及碱性磷酸酶活性检测，可发现不同生物衍生骨支架材料上均存在细胞附着生长的情况，且均无致瘤性和细胞毒性，并具有良好的生物相容性。生物医用材料植入体内与机体的反应首先发生于植入材料的表面/界面，即材料表面/界面对体内蛋白/细胞的吸附/黏附^[32-34]。传统材料的主要问题是对蛋白/细胞的随机吸附/黏附，包括蜕变蛋白的吸附，从而导致炎症、异体反应、植入失效^[35-36]。控制材料表面/界面对蛋白的吸附、进而细胞行为，是控制和引导其生物学反应、避免异体反应的关键^[37-38]。骨髓间充质干细胞是骨组织工程的理想种子细胞，以生物衍生骨为载体，复合骨髓间充质干细胞，可以在体外环境下构建具有有生命活力的种植体^[39]。

本次实验过程中，即通过体外实验分析生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞体外黏附的方式，了解生物衍生骨材料的细胞毒性及其与骨髓间充质干细胞的生物相容性。本次实验结果显示，经扫描电镜观察，可见经传代培养的兔骨髓间充质干细胞杂细胞数量显著下降，形成细胞集落，并围绕集落呈现出放射样排列，即表明骨髓间充质干细胞处于旺盛生长状态。对生物衍生骨与兔骨髓间充质干细胞复合培养之后进行观察，可见在培养后 3 d，细胞即开始在衍生骨材料表面发生附着；培养5 d，细胞连接成片呈层状生长，细胞之间紧密接触；培养7 d后观察，细胞呈现出多层生长状态，成堆生长，即表明兔骨髓间充质干细胞在生物衍生骨上发生了良好的附着。本次实验结果还显示，兔骨髓间充质干细胞与生物衍生骨复合培养后，细胞逐渐从潜伏适应期进入生长对数期及入平台期，生长情况良好，即表明异种生物衍生骨材料细胞毒性低，其与骨髓间充质干细胞之间具备良好的生物相容性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程