姜黄素对骨髓间充质干细胞诱导肾移植免疫耐受的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有研究显示在大鼠肾移植时连续给予1×10⁷细胞浓度的骨髓间充质干细胞可诱导免疫耐受，但临床上尚未发现姜黄素对肾移植具有免疫调节作用。

目的：在对肾移植后的大鼠给予骨髓间充质干细胞的基础上，同时给予不同剂量姜黄素，观察其免疫耐受的效果。

方法：建立大鼠肾移植模型，随机分为4组：纯肾移植组，无治疗措施；骨髓间充质干细胞组：关腹前左骼静脉注射1×10⁷/kg骨髓间充质干细胞，第2天起尾静脉注射等量细胞，共10 d；骨髓间充质干细胞+低/高剂量姜黄素组：除给予骨髓间充质干细胞外，分别以2，10 mg/kg姜黄素溶液灌胃，共10 d。免疫组织化学染色法检测各组肾组织中转化生长因子β1的蛋白表达水平，酶联免疫吸附法检测血清中白细胞介素2，6水平。

结果与结论：大鼠经肾移植后，纯肾移植组中肾小管上皮细胞以及间质细胞的转化生长因子β1蛋白表达、白细胞介素2，6水平均高于其他各组(P < 0.05)。与骨髓间充质干细胞组比较，骨髓间充质干细胞+低/高剂量姜黄素组的转化生长因子β1的蛋白表达降低(P < 0.05)，血清白细胞介素2，6水平均低于骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)。结果证实，大鼠肾移植时同时给予姜黄素与骨髓间充质干细胞注射，可有效地进行免疫调节，抑制性免疫排斥反应的发生，保护肾功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 姜黄素, 骨髓间充质干细胞, 大鼠, 肾移植, 免疫耐受, 免疫排斥, 免疫调节, 转化生长因子β1, 白细胞介素2, 白细胞介素6, 广东省自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have shown that continuous administration of 1×10⁷ of bone marrow mesenchymal stem cells can induce immune tolerance in rats undergoing kidney transplantation, but it is not yet found clinically that curcumin exerts an on immunomodulatory effect on kidney transplantation.

OBJECTIVE: To investigate the effects of different concentrations of curcumin on bone marrow mesenchymal stem cells-induced immune tolerance in rats after kidney transplantation.

METHODS: Rat model of kidney transplantation was made, and rat models were randomly divided into four groups: transplantation group with no treatment; bone marrow mesenchymal stem cells group (cell group) injected with 1×10⁷/kg bone marrow mesenchymal stem cells via the left iliac vein (before peritoneal suture) and tail vein (from the 2^nd day) for 10 days; bone marrow mesenchymal stem cells+low/high dosage of curcumin groups (low/high dosage curcumin groups) injected intragastrically with 2 or 10 mg/kg curcumin combined with injection of bone marrow mesenchymal stem cells for 10 days. Transforming growth factor-β1 protein expression in the kidney tissues was examined by immunohistochemical staining. The concentrations of interleukin-2 and interleukin-6 in serum were detected by ELISA assay.

RESULTS AND CONCLUSION: After kidney transplantation, the protein expression of transforming growth factor-β1 in renal tubular epithelial cells and renal interstitial cells as well as the concentrations of interleukin-2 and interleukin-6 in serum were significantly higher in the transplantation group than the other groups (P < 0.05). Compared with the cell transplantation group, the protein expression of transforming growth factor-β1 as well as the concentrations of interleukin-2 and interleukin-6 reduced significantly in the low/high dosage curcumin groups (P < 0.05). These findings indicate that simultaneous administration of curcumin and bone marrow mesenchymal stem cells can effectively inhibit immune rejection reaction and improve renal function in rats after kidney transplantation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Tissue Engineering, Kidney Transplantation, Interleukins

中图分类号:

R394.2

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Zhang Li-li, Lv Jun, Wan Xia, Xu An-ping. Effects of curcumin on mesenchymalstem cells-induced immune tolerance to kidney transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4450-4454.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析纳入大鼠25只，成功率为96%，建模成功24只，建模失败1只，最终进入结果分析24只。

2.2 分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞形态原代细胞培养1周后，细胞由圆形逐渐变为多角形，梭形，形成细胞集落。培养2周时，梭形细胞逐渐变长，增多，呈辐射状或漩涡状生长，细胞边界逐渐联合、不清，至达到浓度80%-90%融合，此为原代细胞(P0)。细胞传代后，细胞生长速度比原代快，5-7 d可达80%-90%融合，到第3代(P3)时多以梭形细胞为主，细胞形态均一，见图1。

2.3 肾移植后大鼠肾脏转化生长因子β1蛋白的表达转化生长因子β1的表达主要是在肾小管上皮细胞中，免疫组织化学染色结果显示，纯肾移植组中肾小管上皮细胞以及间质细胞的转化生长因子β1表达呈强阳性，骨髓间充质干细胞组，骨髓间充质干细胞+低剂量姜黄素组和骨髓间充质干细胞+高剂量姜黄素组中的转化生长因子β1表达较弱均低于纯肾移植组(P < 0.05)；加入姜黄素后，转化生长因子β1表达更弱，但高、低剂量姜黄素组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2，表1。

2.4 肾移植后各组大鼠血清中白细胞介素2，6水平 ELISA法检测肾移植后各组大鼠血清中白细胞介素2，6的质量浓度，结果显示，纯肾移植组中白细胞介素2，6质量浓度显著高于其他各组(P < 0.05)；骨髓间充质干细胞加高/低剂量姜黄素组的白细胞介素2，6质量浓度均低于骨髓间充质干细胞组(P < 0.05)；姜黄素剂量的高低对白细胞介素2，6水平影响不显著。见表2。

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引言

肾移植作为治疗终末期肾衰竭患者的最有效手段，能够显著提高患者的生存时间，但是由于存在免疫排斥反应，导致临床上肾移植存在巨大挑战。随着免疫抑制剂的出现，急性排斥反应率显著下降，但移植肾患者的存活率并没有得到较好的改善^[1-2]。

骨髓间充质干细胞是骨髓中的非造血细胞集落，具有低免疫原性、免疫抑制的特性，无论对来自供者或受者的骨髓间充质干细胞均具有相同的免疫调节作用。研究发现人肾移植供者来源的脂肪间充质干细胞在体外能显著抑制受体-供体的混合淋巴细胞反应，显著抑制肾移植受体移植前和移植后T细胞的增殖^[3]。

已有研究证明了在大鼠肾移植时连续给予1×10⁷的骨髓间充质干细胞可诱导免疫耐受^[4-5]。Zhang等^[6]研究发现单独使用间充质干细胞或联合短期(2 d)使用小剂量的环孢素A对大鼠肾移植早期有保护作用，可减少移植肾组织炎症递质如白细胞介素1和转化生长因子β等的表达。

Inoue等^[7]在小鼠的心脏移植模型研究中发现通过输注间充质干细胞不仅不能延长心脏移植物的存活期，甚至反而加速了小鼠的排斥反应。而同期开展的体外实验又证实间充质干细胞在体外确实不表达MHC-Ⅱ类抗原和T细胞共刺激分子，在混合淋巴细胞反应中能抑制T细胞的增殖。有研究改变方案，在心脏移植前4 d开始输注间充质干细胞，同时给予小剂量的免疫抑制剂，发现能明显延长移植小鼠的存活期^[8]。

姜黄素是姜黄块根中的主要有效成分，具有双阿魏酰甲烷的结构，具有抗炎、抗病毒、抗菌及抗癌的疗效^[9-13]，已得到广泛的临床证实。已有实验研究表明姜黄素能有效地降低血液中的白细胞介素1β，白细胞介素6，白细胞介素12，肿瘤坏死因子α以及内毒素水平，改善肝、肾、凝血多器官的功能，改善血管反应性^[14-16]，但国内外尚未有研究表明姜黄素对肾移植的免疫抑制方面的作用。

实验中作者分离Wistar大鼠间充质干细胞进行培养传代，观察在肾移植大鼠模型中，不同剂量的姜黄素和骨髓间充质干细胞对肾移植大鼠免疫耐受的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验。
1.2 时间及地点于2014年1至9月在中山大学干细胞实验室完成。
1.3 材料成年Wistar雄性大鼠24只，9-11周龄，体质量240-280 g，作为供体；另取成年Wistar雄性大鼠24只，9-11周龄，体质量250-300 g，作为受体。饲养Wistar雄性大鼠5只，5周龄，用作提取骨髓间充质干细胞。实验动物由中山大学中山医学院实验动物中心提供(许可证号DC1.02.65541)。
将24只大鼠抽签随机分为4组：纯肾移植组，骨髓间充质干细胞组，骨髓间充质干细胞+低剂量姜黄素组，骨髓间充质干细胞+高剂量姜黄素组，每组6只。

姜黄素对骨髓间充质干细胞诱导肾移植免疫耐受实验用主要试剂及设备：
试剂及设备	来源
显微外科手术器械	上海医疗器械集团有限公司
医用无损伤缝合线	上海医用缝合线厂
10%水合氯醛、胰蛋白酶	Sigma
肝素钠	南京新百药业有限公司
姜黄素	陕西源邦生物技术有限公司
胎牛血清	杭州四季青生物工程有限公司
大鼠白细胞介素2，6试剂盒	上海酶联生物科技有限公司

1.4 实验方法

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养：将Wistar雄性大鼠颈椎脱臼处死，在无菌条件下取胫骨和股骨，保持骨髓腔无菌封闭状态置于体积分数75%乙醇浸泡3 min，洗去多余的组织，用注射器抽取4 mL DMEM培养液，穿刺入骨髓腔，反复冲洗骨髓3-5次，收集至15 mL离心管，制成细胞悬液，1 000 r/min，离心5 min，弃上清；用含体积分数20%胎牛血清培养基重悬细胞，以1×10⁷个接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数5%CO₂饱和湿度的培养箱培养，每隔3 d换液1次。当细胞铺满培养瓶平底80%-90%时进行传代，取第3代生长状态良好的细胞进行实验。

建立大鼠肾移植模型：麻醉大鼠后，游离左右肾，腹主动脉插入灌注针，匀速灌注含肝素钠的肾保养液，分离出双肾，置于4 ℃生理盐水保存，将双肾移植至肾脏已被切除的大鼠体内，吻合血管^[17]。

给药方式：纯肾移植组在移植后，未接受骨髓间充质干细胞或环孢素A治疗；骨髓间充质干细胞组，移植当天关腹前左骼静脉注射1×10⁷/kg的骨髓间充质干细胞，第2天起尾静脉注射等剂量骨髓间充质干细胞，1次/d，共10 d；骨髓间充质干细胞+低剂量姜黄素组，除给予骨髓间充质干细胞外，姜黄素溶液灌胃，2 mg/kg，1次/d，共10 d；骨髓间充质干细胞+高剂量姜黄素组，除给予骨髓间充质干细胞外，姜黄素溶液灌胃，10 mg/kg，1次/d，共10 d。

免疫组织化学染色法检测转化生长因子β1的蛋白表达：移植后5周将大鼠处死，迅速摘取大鼠肾脏，以体积分数10%甲醛固定液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片厚度为8 μm。

将肾脏组织石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，乙醇梯度脱水，洗涤，置于体积分数5%BSA封闭液20 min，加入稀释后的转化生长因子β1抗体，37 ℃孵育1 h，显色。苏木精复染，返蓝，脱水，于二甲苯中浸泡，加入中性树胶，封固晾干。

根据染色细胞所占面积和细胞染色强度两项指标进行综合评分判断。综合评分为(染色细胞分数+细胞染色强度分数)/2，0-0.5分为(-)；0.5-1.5分为(+)；1.5-2.5分为(++)；> 2.5分为(+++)^[18]。

ELISA法检测血液中白细胞介素2，6水平：移植后1周，尾静脉取血，将标准品10 μL加入标准孔，将10 μL血清加入相应反应孔中，振荡混匀，37 ℃孵育30 min，洗板，加入显色液，轻轻振荡混匀30 s，37 ℃避光孵育30 min，加入终止液，于450 nm波长处测定各孔的吸光度值，计算相应的样品浓度。

主要观察指标：各组肾脏转化生长因子β1的蛋白表达水平、血清中白细胞介素2，6表达水平。
1.5 统计学分析计量资料以x(_)±s表示，使用SPSS软件15.0进行数据分析，组间数据差异的比较采用独立样本t 检验，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞主要存在与结缔组织和器官间质，以骨髓组织中含量最丰富，是一类具有自我更新、横向分化和免疫调节的多功能干细胞，统称为骨髓间充质干细胞^[19]。近年来在各种创伤修复、组织功能重建的研究领域中，骨髓间充质干细胞具有广泛的应用前景。骨髓中的骨髓间充质干细胞含量非常少，为0.001%-0.01%，需在体外进行培养扩增^[20-21]。

由于不同年龄段大鼠的骨髓间充质干细胞的体外增殖能力不同，随着年龄增大，增殖能力显著下降，研究表明4-12周龄大鼠的骨髓间充质干细胞增殖及分化能力较强^[22]。因此实验从5周龄大鼠的骨髓中分离培养骨髓间充质干细胞。采用P3代的细胞进行后续实验，是因为P3代的骨髓间充质干细胞更稳定。

转化生长因子β1与肾脏的纤维化病变具有密切关系的细胞因子^[23-24]。转化生长因子β，在哺乳动物中具有1，2，3共3种异构体，在不同组织的分布具有特异性^[25]。转化生长因子β1在肾脏的表达最多，由肾小球和肾小管的上皮细胞分泌，是转化生长因子β家族中最具特征性的分子^[26-27]。

转化生长因子β1是重要的免疫调节因子，参与多个生物过程，可抑制T细胞的活化与扩增，可维持机体的免疫稳态以及诱导自身耐受。同时，转化生长因子β1具有较强的刺激纤维增生作用，促进纤维细胞的生长^[28]。因此转化生长因子β1所表现出来的功能取决于机体组织细胞所处的不同病理状态。

研究表明，在肾的病理状态下，转化生长因子β1是各种肾病肾小球硬化和肾间质纤维化发生发展的必要因子，转化生长因子β1的过度表达可在多种肾病下引起不可逆的肾间质纤维化。

实验中肾移植后的大鼠给予骨髓间充质干细胞治疗后，转化生长因子β1的蛋白表达显著低于纯肾移植组，提示骨髓间充质干细胞在肾移植大鼠体内可下调转化生长因子β1在肾组织的表达，推测其原因可能是骨髓间充质干细胞通过免疫抑制机制作用实现。实验同时给予骨髓间充质干细胞和姜黄素后，转化生长因子β1的蛋白表达明显低于单给予骨髓间充质干细胞的大鼠，提示姜黄素能够加强骨髓间充质干细胞在肾移植大鼠体内下调转化生长因子β1在肾组织表达的作用，转化生长因子β1的低表达可避免出现肾间质纤维化，从而避免产生肾病变，其确切的机制有待进行下一步研究。

白细胞介素2，6水平是移植肾急性排斥的指标。当移植肾发生排斥反应时，Th1细胞被激活后导致白细胞介素2分泌增加，白细胞介素2水平的升高促使白细胞介素6分泌的增加，从而直接促进T、B淋巴细胞的激活和增殖^[29-30]，因此，白细胞介素2，6水平的升高预示着急性排斥反应的发生^[31-32]。

实验观察肾移植后大鼠在无任何治疗下，白细胞介素2，6水平显著高于其他进行治疗的组别，出现排斥反应。同时给予骨髓间充质干细胞和姜黄素治疗后，白细胞介素2，6水平明显低于单独给予骨髓间充质干细胞，提示姜黄素能够与骨髓间充质干细胞起协同作用，抑制急性免疫排斥反应的发生。

实验首次对姜黄素联合骨髓间充质干细胞治疗肾移植后的免疫排斥反应进行研究，发现姜黄素能促进骨髓间充质干细胞更有效地进行免疫调节，抑制性免疫排斥反应的发生，保护肾功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程