适当质量浓度黄芪注射液可增强骨髓基质细胞的表面黏附性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.28.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究发现很多益气补血类中药均是通过影响骨髓基质细胞分泌一些细胞因子来促进造血干细胞的分化增殖，或者促进骨髓基质细胞和造血干细胞的黏附而发挥作用。

目的：观察黄芪注射液对小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1表达的影响。

方法：采用全骨髓贴壁细胞分离筛选法培养小鼠骨髓基质细胞，倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色光镜及透射电镜观察小鼠骨髓基质细胞的形态。MTT法检测黄芪注射液促进骨髓基质细胞增殖的最佳浓度。流式细胞术检测黄芪注射液干预后小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1的表达。

结果与结论：倒置显微镜和光镜观察到骨髓基质细胞呈贴壁生长，细胞呈梭形或不规则形态，有突起；透射电镜观察到细胞内细胞器丰富，如粗面内质网、分泌小泡、线粒体等。黄芪注射液质量浓度为400和600 mg/L时可促进小鼠骨髓基质细胞增殖(P < 0.05)，且两种剂量组间比较差异无显著性意义。600 mg/L黄芪注射液可增加小鼠骨髓基质细胞表面细胞间黏附分子1、血管细胞间黏附分子1蛋白表达。结果表明适当质量浓度黄芪注射液能够增强基质细胞的黏附性，对造血微环境有改善作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 黄芪注射液, 小鼠骨髓基质细胞, 细胞间黏附分子1, 血管细胞间黏附分子1

Abstract:

BACKGROUND: Several studies have demonstrated that many kinds of Chinese herbs for benefiting vital energy and enriching the blood secrete some cytokines by influencing bone marrow stromal cells to promote the differentiation and proliferation of hemopoietic stem cells or exert effects by promoting the adhesion of bone marrow stromal cells and hemopoietic stem cells.

OBJECTIVE: To investigate the effects of Radix Astragali injection on the expression of intercellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 on the surface of mouse bone marrow stromal cells.

METHODS: Mouse bone marrow stromal cells were isolated by adherent culture of whole bone marrow. The morphology of mouse bone marrow stromal cells were observed using inverted phase microscopy, hematoxylin-eosin staining, optical microscopy and transmission electron microscopy. The optimal concentration at which Radix Astragali injection exhibited the strongest effects on promoting the proliferation of bone marrow stromal cells was detected using MTT assay. Expression of intercellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 on the surface of mouse bone marrow stromal cells was detected using flow cytrometry after intervention by Radix Astragali injection.

RESULTS AND CONCLUSION: Inverted phase microscopy and optical microscopy showed that bone marrow stromal cells adhered to the wall of culture flask, exhibited a shuttle-shaped or irregular appearance with processes. Through transmission electron microscopy, organelles were abundant, such as rough endoplasmic reticulum, secretory vesicle, and mitochondria. Radix Astragali injection at 400 and 600 mg/L significantly promoted the proliferation of mouse bone marrow stromal cells (P < 0.05) and there was no significant difference in the cell proliferation between these two concentrations. Radix Astragali injection at 600 mg/L increased the expression of intercellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 on the surface of mouse bone marrow stromal cells. These findings suggest that Radix Astragali injection at appropriate concentrations can increase the surface adhesion of bone marrow stromal cells, thereby improving hemopoietic microenvironment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Astragalus membranaceus, Cell Adhesion Molecules, Intercellular Adhesion Molecule-1Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Astragalus membranaceus, Cell Adhesion Molecules, Intercellular Adhesion Molecule-1

中图分类号:

R318

王彩霞，任明姬，崔明玉. 适当质量浓度黄芪注射液可增强骨髓基质细胞的表面黏附性[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(28): 4445-4449.

Wang Cai-xia, Ren Ming-ji, Cui Ming-yu. Radix Astragali injection at appropriate concentrations enhances surface adhesion of bone marrow stromal cell[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(28): 4445-4449.

图/表（结果） 4

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：实验于2007年3至7月在内蒙古医科大学临床实验室完成。
材料：

含黄芪注射液的培养基培养小鼠骨髓基质细胞所用主要试剂：
试剂	来源
FITC anti-mouse CD106(VCAM-1)、PE anti-mouse CD54(ICAM-1)	深圳晶美生物制品有限公司
黄芪注射液	成都地奥九泓制药厂
DMEM低糖细胞培养基	Gibco公司
胎牛血清	天津市灏洋生物制品科技有限责任公司
胰蛋白酶	日本进口分装，上海化学试剂公司
MTT、二甲基亚砜	Sigma 公司

实验动物：4-6周龄健康雄性昆明小鼠，清洁级，体质量(18±2) g，购自内蒙古大学动物中心。

实验方法：

小鼠骨髓基质细胞体外培养：参照Dexter等^[3]创立的全骨髓贴壁细胞分离筛选法。

小鼠骨髓基质细胞分离与原代培养：①采用颈脱臼法处死小鼠，体积分数为75%乙醇浸泡约5 min。②用剪刀和镊子在无菌条件下分离出双侧股骨与胫骨，PBS冲洗2次后剪除骨两端，再以PBS反复冲洗髓腔，至骨发白。③过4号针头制成单个核细胞悬液，850 r/min离心10 min，去除上清液，用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液反复吹打重悬细胞，调整细胞浓度为(3.0-4.0)×10⁹ L^-¹接种于25 cm²一次性培养瓶中。④置37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。⑤培养4 d后弃上清，PBS洗2次，去除悬浮细胞。⑥加入DMEM完全培养液，以后每2 d换液1次。

小鼠骨髓基质细胞传代培养：①待小鼠骨髓基质细胞长满瓶底时，弃上清，PBS洗涤两三次。②加入胰酶，置37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中孵育5-10 min。③待细胞开始变圆后加入含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液终止消化。④收集消化后的细胞悬液，1 000 r/min离心10 min。⑤弃上清，加入完全培养液，以1︰2的比例传代培养。⑥第2代细胞用于实验。

小鼠骨髓基质细胞的镜下观察：

倒置显微镜观察：自原代培养开始观察不同时间点细胞的生长特点和形态变化。

苏木精-伊红染色光学显微镜观察：第2代细胞用体积分数为95%乙醇固定30 min，PBS清洗1.0-2.0 min，苏木精染色20 min，去掉染液自来水中漂洗，伊红染色6.0-7.0 min，自来水冲去伊红液，体积分数为80%乙醇中浸入即取出，体积分数为100%乙醇中5 min，二甲苯Ⅰ 5 min，二甲苯Ⅱ 5 min，树胶封固，光学显微镜下观察。
镊子在无菌条件下分离出双侧股骨与胫骨，PBS冲洗2次后剪除骨两端，再以PBS反复冲洗髓腔，至骨发白。③过4号针头制成单个核细胞悬液，850 r/min离心10 min，去除上清液，用含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液反复吹打重悬细胞，调整细胞浓度为(3.0-4.0)×10⁹ L^-¹接种于25 cm²一次性培养瓶中。④置37 ℃、体积分数为5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。⑤培养4 d后弃上清，PBS洗2次，去除悬浮细胞。⑥加入DMEM完全培养液，以后每2 d换液1次。

小鼠骨髓基质细胞的镜下观察：

倒置显微镜观察：自原代培养开始观察不同时间点细胞的生长特点和形态变化。

讨论

造血干细胞是髓系和淋巴系细胞的始祖细胞。造血干细胞的增殖与分化、血细胞生成与释放、血细胞数量动态平衡维持与血细胞衰老死亡均受造血诱导微环境的精密调控^[4]，骨髓基质细胞是造血诱导微环境的核心成分，其生物学特点可以反映造血微环境的功能状态^[5]。基质细胞包括成纤维细胞、网状细胞、巨噬细胞、血窦内皮细胞、骨髓基质干细胞等成分，其除了为造血提供支架和分泌造血调节因子，还能产生网状纤维、黏性糖蛋白等细胞外基质，对造血细胞具有黏附和固定的作用^[6-7]。

研究表明，骨髓基质细胞高表达基质细胞衍生因子、干细胞因子、血管生成素1、细胞间黏附分1、血管细胞黏附分子1以及骨桥蛋白，这些因子与基质细胞支持造血功能密切相关^[8]。骨髓基质细胞的本质作用是抑制“免疫监控”及创造一个有利于受损组织修复再生的微环境，这种效应的达成可通过细胞因子的分泌及细胞间直接接触获得^[9]，基质细胞分泌黏附因子如VCAM-1、ICAM-1和SDF-1。研究表明，造血细胞表面整合素分子VLA-4、VLA-5、LFA-1等激活后^[10]，分别与骨髓基质干细胞及细胞外基质相应配体Fn、VCAM-1、ICAM-1识别，介导黏附反应，通过黏着斑与细胞内actin相连，调节细胞骨架重新组装及蛋白微丝收缩，促进造血细胞的迁徙和归巢^[11-12]。在众多的细胞黏附分子中，VCAM-1、ICAM-1可以协助造血干细胞黏附，在造血干细胞发育的微环境中参与造血细胞与基质细胞聚集体的形成，并参与造血细胞的归巢和迁移^[13]。本实验可见骨髓基质细胞有粗细不均的胞质突起，透射电镜下可见丰富的细胞器，如核糖体、粗面内质网、分泌小泡、线粒体等，细胞表面可见微绒毛突起，提示该细胞具有较强的蛋白质合成能力，是其能够分泌许多生长因子维持自身生长分化、支持造血干细胞造血的结构基础。

黄芪有效成分有皂苷类及多糖类^[14]。研究报道，黄芪能有效降低血液黏稠度，改善机体组织器官营养和血液供给，降低微血管病变风险和程度，对心血管疾病的防治有良好作用^[15]；黄芪可抑制血小板凝集，促进造血干细胞分化和增殖，保护和促进造血功能恢复^[16]；黄芪注射液能增加外周血内皮祖细胞数量，促进内皮祖细胞的增殖、迁移、黏附和体外血管形成能力^[17]。在中药改善造血功能的研究中发现，黄芪能促进骨髓细胞核酸及蛋白质的合成，加快有核细胞分裂，增加血细胞数^[18]。李美芬等^[19]报道，黄芪可促进正常小鼠骨髓粒系造血。在研究益气补血类中药对造血因子及造血微环境的影响中发现，很多促进造血细胞增殖的有效成分均是通过影响骨髓基质细胞分泌一些细胞因子促进造血干细胞的分化增殖，或者促进骨髓基质细胞和造血干细胞的黏附而起作用的^[20]。王乾兴等^[21]研究报道，黄芪多糖可能通过调节细胞周期相关蛋白的表达延缓小鼠造血干细胞衰老。祝晓玲等^[22]研究发现，黄芪注射液可以促进贫血小鼠骨髓成纤维细胞集落增殖，升高贫血小鼠骨髓基质细胞分泌干细胞因子的水平。

实验结果显示质量浓度为400 mg/L和600 mg/L的黄芪注射液可以明显促进小鼠骨髓基质细胞的增殖(P < 0.01)，且这两种质量浓度组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。而质量浓度为200，800，1 000 mg/L的黄芪注射液对小鼠骨髓基质细胞无明显增殖作用，因此选用600 mg/L黄芪注射液作为促骨髓基质细胞增殖的最佳浓度。黄芪注射液能促进骨髓基质细胞增殖，这可能与黄芪能提高小鼠股骨骨髓中的有核细胞数量有关；研究还显示黄芪注射液可以明显促进骨髓基质细胞表面VCAM-1、ICAM-1蛋白表达，可能是黄芪注射液促进基质细胞分泌多种造血因子，这些造血因子联合作用增加了基质细胞的黏附特性。

综上所述，黄芪注射液能够增强基质细胞的黏附性，对造血微环境有改善作用。