设计:细胞水平,体外对比观察性实验。
时间及地点:实验于2013年8至10月在广东省中医院大学城分院中心实验室完成。
材料:
实验动物:雄性SD大鼠2只,3周龄,SPF级,体质量(100±10) g,由广州中医药大学动物实验中心提供,许可证号:SCXK(粤)2008-0020,动物合格证号4405900586。实验过程中对大鼠的操作均按照广东省中医院实验动物伦理委员会标准执行,符合动物福利的基本原则、3R原则等相关的要求。
药品:龙鳖胶囊由广东省中医院制剂中心生产, 0.5 g/粒,批号:粤药制字Z20071030。
SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、增殖活性检测所用主要试剂和仪器:
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试剂和仪器
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来源
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澳洲胎牛血清
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Gibco,Lot 1227693
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2.5 g/L胰蛋白酶EDTA
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Gibco,Lot 1297729
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碱性成纤维细胞生长因子
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Prospec,Lot313PRFGF2
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L-DMEM
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Gibco,Lot 1237443
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青链霉素
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Hyclone,Lot J130014
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PBS
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Hyclone,Lot AYA54530
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MTT
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Sigma,Lot MKBP6775V
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二甲基亚砜
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MP,Lot6349K
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Hepes Free Acid
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鼎国生物科技公司
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碳酸氢钠
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广州化学试剂厂
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Anti-Rat CD45 PE-CY5 MAB 0.1MG OX-1
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BD Pharmingen,Lot2277797
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Anti-Rat CD29 PE MAB 0.05MG HA2/5
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BD Pharmingen,Lot2257636
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Anti-Rat CD44H FITC MAB 0.1MG
OX-49
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BD Pharmingen,Lot3235614
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Anti-Rat CD90 MS CD90.1 PE-CY7
0.05MG OX-7
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BD Pharmingen,Lot3106690
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Mouse/Rat CD34 Affinity Purified
Polyclonal Ab
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R&D,LotCEPJ0112031
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二抗Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) PerCP
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R&D,LotABSZ0212031
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同型对照MS IGG2A ITCL NHP FITC
50TST G155-178
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BD Pharmingen,Lot2277661
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同型对照MS IGG1 KPA NHP PE-CY5 50TST MOPC-21
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BD Pharmingen,Lot3057802
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同型对照MS IGG1 KPA ITCL PE-CY7 100TST MOPC-21
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BD Pharmingen,Lot3309931
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同型对照 HAM IGM LAM ITCL PE MAB 0.1MG G235-1
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BD Pharmingen,Lot3308744
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同型对照Normal Sheep IgG Control
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R&D,LotWAX0213071
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医用离心机
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北京白洋医用离心机有限公司
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倒置显微镜
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Nikon
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CO2培养箱
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Thermo Scientific
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超净工作台
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ESCO
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VictorX5多标记微孔板检测仪
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PE
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流式细胞仪
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Beckman Coulter
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实验方法:
培养基的配制:1包L-DMEM配约1 000 mL高压灭菌后的纯水,混合后放入烧杯搅拌4 h,加入碳酸氧钠2.85 g和Hepes 2.38 g,检测培养基pH值,将pH值调至7.20-7.40范围,继续搅拌2-4 h。用0.22 μm一次性过滤器过滤培养基,装入蓝口瓶中,4 ℃保存备用。加入双抗、澳洲胎牛血清配置成完全培养基。
骨髓间充质干细胞生长因子的制备:在10 mL的PBS中加入10 μg的碱性成纤维细胞生长因子和10 mg的牛血清白蛋白配置成骨髓间充质干细胞生长因子溶液,用1 mL的离心管分装,-20 ℃保存备用。
MTT的配制:称取100 mg噻唑蓝,用高压灭菌的纯水20 mL稀释成5 g/L的MTT工作液体,置超净台操作避光,反复吹打,使MTT充分溶解,0.22 μm一次性过滤器过滤。装入5 mL EP管中,-20 ℃保存备用。
龙鳖胶囊溶液的制备:取龙鳖胶囊8粒×0.5 g/粒=4 g,用50 mL纯水进行煎煮,大火烧开后,文火继续熬至 60 min,冷却,10 000 r/min离心15 min取上清液,将上清液用蒸发皿蒸干,得到油胶状药样2.149 5 g,用40 mL基础培养基将2.149 5 g样品溶解,超声促溶,然后测定药液的pH为7.32,0.22 μm滤头过滤后得到40 mL的药液,按原药材量折算药液质量浓度相当于100 g/L,-20 ℃冰箱保存备用。
SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离:采用全骨髓法(直接培养法)分离培养。①取体质量为100 g左右的雄性SD大鼠,颈椎脱臼处死,用体积分数为75%乙醇浸泡3-5 min(头部朝下,使乙醇没过于全身)。②移置细胞培养用超净台内,剪开大鼠腿部皮肤,分离腿部肌肉,取出大鼠股骨、胫骨。③用无菌纱块剔除大鼠股骨、胫骨部附着的肌肉组织,置入25 cm2培养皿中备用。④用注射器吸取含有体积分数为12%胎牛血清的L-DMEM 10 mL,备用。⑤用剪刀去除大鼠股骨、胫骨一端的软骨帽,将含有10 mL培养基的注射器插入骨髓腔内缓慢冲洗四五遍,直至股骨、胫骨变成白色,尽量冲出骨骺中的细胞。⑥将冲洗好的细胞移入15 mL离心管中,进行1 000 r/min离心,5 min后去除上清液,再重新加入8 mL完全培养基,用巴氏吸管吹打均匀后分别种入25 cm2的培养瓶里,并放入37 ℃,体积分数为5% CO2培养箱中进行培养。⑦原代培养48 h,待细胞贴壁生长后进行第1次换液,两三天后细胞增殖达到80%-90%融合,第1代细胞以1︰1传代,并加入碱性成纤维细胞生长因子(培养瓶中培养基量的1/200),第1代以后传代则以1︰2传代。
骨髓间充质干细胞的鉴定:采用流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面标志CD29、CD90、CD45、CD44、CD34的表达,具体操作如下:将第3代骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化后置于15 mL离心管中,细胞计数,以每管(1-10)×105分装至2个5 mL离心管中,标记为A管、B管,离心,去上清,用PBS冲洗2次;分别在A管中加入CD29、CD44、CD45、CD90、CD34一抗2 μL,B管中加入相对同型抗体,4 ℃避光孵育30 min。PBS洗涤2次后,加入二抗Anti-sheep IgG,4 ℃避光孵育30 min,PBS洗涤2次,加入500 μL PBS重悬,上流式细胞仪检测。
龙鳖胶囊溶液对骨髓间充质干细胞活性的影响:实验分为2组,分别为对照组、龙鳖胶囊组。采用浓度梯度法用完全培养基对龙鳖胶囊溶液进行配液,其中龙鳖胶囊组质量浓度依次为5,1 g/L,250,50,10 mg/L。取第4代骨髓间充质干细胞以每孔5 000个细胞接种于96孔板中,每孔接种200 μL L-DMEM,于96孔板最外一圈孔加入 200 μL PBS。贴壁生长后,对照组继续用完全培养基培养,其他组换配好质量浓度的龙鳖胶囊溶液,培养24 h后进行检测,每孔分别加入5 g/L的MTT溶液20 μL,并于培养箱内37 ℃条件下避光孵育4 h后,小心去除上清,每孔加入二甲基亚砜溶液150 μL,水平振荡仪器上振荡5 min,待蓝紫色结晶甲瓒颗粒充分溶解后,用VictorTMX5多标记微孔板检测仪测定各孔在570 nm波长处的吸光度值(A值),计算各组10孔吸光度值的平均值。以培养时间为横坐标,平均吸光度值为纵坐标,绘制生长曲线。
主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的形态和表面标志。②不同质量浓度龙鳖胶囊溶液对骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。
统计学分析:采用Excel软件建立数据库,转化生成SPSS 18.0统计软件包数据库,进行数据处理和统计学分析。计量资料以x±s表示,多组间比较采用方差分析(ONE-WAY ANOVE),两两比较采用LSD-t 检验,检验水平α=0.05。