建立放射性脑损伤兔模型及磁共振参数选择

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.27.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：放射性脑损伤是近些年关注和研究的热点，尤其是动物实验研究，国内外研究显示，磁共振成像检查放射性脑损伤动物模型尚无统一扫描参数，文章通过行家兔颅脑磁共振成像，确定磁共振扫描各序列参数。
目的：建立新西兰兔放射性脑损伤动物模型，并利用LOOP7线圈获取兔颅脑磁共振(MR)图像，为深入研究放射性脑损伤早期磁共振诊断提供基础。
方法：使用LOOP7线圈分别行T2加权成像、弥散张量成像、磁共振波谱分析及磁敏感加权成像的多次扫描，确定每个序列的最佳扫描参数。建立放射性脑损伤兔模型，于右半脑分别接受40，80，120 Gy的6 MV X射线单次大剂量照射，观察实验兔的日常表现和动态的颅脑磁共振征象，当磁共振检测出现异常或随访20周后取脑组织行病理学检查。
结果与结论：40 Gy组仅1例发生硬膜下出血，其他未见异常；80 Gy组T2WI均可见异常信号，病理证实为散在神经元变性和中性粒细胞浸润；120 Gy组磁共振检查均可见随时间逐渐扩大的异常信号影，病理证实为放射性脑病。结果证实，通过放射治疗系统制定放疗计划，制作放射性脑损伤兔模型，能很好的模拟放射性脑损伤的发生过程，且该模型能适用于临床常规LOOP7线圈的磁共振检查。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

关键词: 实验动物, 脑及脊髓损伤动物模型, 辐射损伤, 脑损伤, 动物模型, 兔, 核磁共振, 磁敏感加权成像, 弥散加权成像, 弥散张量成像, 功能磁共振成像, 磁共振波谱

Abstract:

BACKGROUND: Radiation-induced brain injury has recently become an increasing area of research, in particular in animal experimental studies. Domestic and international researches show that there have been no uniform scanning parameters used for examination of animal models of radiation-induced brain injury by magnetic resonance imaging. In this study, we performed magnetic resonance imaging in rabbits to determine related sequence parameters.
OBJECTIVE: To establish the New Zealand rabbit models of radiation-induced brain injury, and obtain the brain magnetic resonance images of rabbits using LOOP7 coil, so as to provide experimental evidence for diagnosis of radiation-induced brain injury by magenetic resonance imaging.
METHODS: Each of T2-weighted imaging, diffusion tensor imaging, magnetic resonance spectroscopy and magnetic susceptibility-weighted imaging were performed several times through the use of LOOP7 coil, to determine the optimal scanning parameters for each sequence. Rabbit models of radiation-induced brain injury were established and then their right hemispheres were irradiated using 6 MV X-rays at a single dose of 40, 80 and 120 Gy. The daily performance and dynamic magnetic resonance signs of rabbits were observed. The brain tissue was taken for pathological examination once abnormal magnetic resonance findings were observed or after 20 weeks of follow-up.
RESULTS AND CONCLUSION: Only one rabbit model in the 40 Gy group had subdural hemorrhage. In the
80 Gy group, abnormal T2-weight imaging signals were observed in all rabbit models, which were pathologically confirmed as scattered degenerated neurons and infiltrated neutrophils. The abnormal signals that gradually expanded over time were seen in rabbits from the 120 Gy group by magnetic resonance imaging and were pathologically confirmed as radiation-induced brain injury loci. The results confirm that establishing rat models of radiation-induced brain injury using radiation therapy system can better simulate the pathological process of radiation-induced brain injury; moreover, this model can be applied to receive routine magnetic resonance examination with LOOP7 coil.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

中图分类号:

R318

郎晓燕，邵国良，孙晶晶，石磊，范林音. 建立放射性脑损伤兔模型及磁共振参数选择[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(27): 4299-4303.

Lang Xiao-yan, Shao Guo-liang, Sun Jing-jing, Shi Lei, Fan Lin-yin. Construction of rabbit models of radiation-induced brain injury and selection of magnetic resonance parameters[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(27): 4299-4303.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析新西兰兔12只均建模成功，无死亡与感染，无其他严重并发症等结果，均进入结果分析。造模流程图见图2。

2.2 造模方法的改进由于实验历时时间长，磁共振检查频繁，需要重复的对动物进行麻醉，加之新西兰兔挣扎力气较大，单纯的耳缘静脉麻醉可能会致耳缘静脉较大范围的损伤及瘢痕组织形成，从而导致后期麻醉操作较困难，实验同时使用2种麻醉剂，首先使用速眠新Ⅱ(安全范围比较大)肌肉注射(操作简单)使动物镇定失去反抗能力，再行3%戊巴比妥钠耳缘静脉缓慢麻醉，避免了因动物反抗造成的不必要的耳缘静脉损伤；使用脑体积较大的新西兰兔，较以往多数研究中使用的大鼠，首先磁共振检查更易获得质量较好的图像；另外，靶区的设定更精确，左半脑未照射区可以作为自身对照组；使用新西兰兔，较大鼠而言，放射后生存时间延长，另外新西兰兔对麻醉剂更加耐受，便于实验的完整性和连续性观察。
2.3 模型稳定性更好放射后，新西兰兔日常反应由初期放射导致的组织水肿所继发的一系列急性反应(如精神萎靡，活动明显减少，摄食饮水行为明显减少甚至消失，急性偏瘫)，至后期的毛发脱落，程度与放射剂量正相关；所有实验动物均出现相应的放射损伤表现，实验可重复、可复制；另外，在放射过程中，靶区表面覆盖了生物等效膜，更接近于人类实际放疗过程。
2.4 X射线照射后兔临床表现放疗后第1天，所有实验动物均有食欲减退，活动减少及淡漠等，第3天后逐渐恢复正常。40 Gy组1只实验兔放疗后迅速出现头向右偏斜，右眼红肿不能睁开并有分泌物，24 h后症状明显好转，约130 d右眼发生放射性白内障；其余3只实验兔放疗后20周期间未见脱毛和其他异常表现。80 Gy组，放疗后约3周1只兔子有局限性的毛发脱落。放疗后约16周，实验兔的活动及进食较放疗前略减少。120 Gy组，放疗后约1周均出现头向右偏，且愈发严重，2周左右出现局部的毛发脱落，其中1只在第54天时不能站立。
2.5 X射线照射后兔脑磁共振成像变化 40 Gy组，1只实验兔放疗后第9周出现右侧硬膜下条状长T2信号(图3A)，且随时间渐增多，考虑为硬膜下出血，其余3只放疗后20周内，T2WI及ADC图上均未见明显异常信号。80 Gy组，放疗后第8，9周，所有实验动物陆续出现沿右侧脑室走行的T2WI稍高信号影，随时间病变范围逐渐扩大，并累及对侧(图3B)。120 Gy组，放疗后第4周左右所有动物都出现右侧海马区可疑稍长T2信号影；第5周右侧海马区T2信号较对侧略高，T2值明显升高；第6周更加明显，右侧海马明显肿胀；第7，8周表现出明显的高低混杂T2信号，且病变范围较前明显扩大，几乎累及整个右侧大脑半球(图3C，D)。

2.6 X射线照射后兔脑组织病理变化
光镜下观察：40 Gy组T2WI上出现硬膜下异常信号的实验兔可观察到近脑膜侧明显的出血表现(图4)，余3只实验兔未见明显异常；80 Gy组，散在的神经细胞变性坏死及细胞水肿，局部有少量中性粒细胞浸润，其间夹杂有淋巴细胞，其中1只还可见室管膜细胞增生；120 Gy组实验兔均见明显的放射性坏死和细胞水肿，周围小血管壁增厚，内皮细胞变性，纤维增生(图4)。

透射电镜下观察：80，120 Gy组均可观察到明显的脱髓鞘(髓板分离、轴突扭曲变形)，轴突(胞质)内线粒体肿胀，胶原纤维增生，细胞凋亡(染色质边集、核仁消失)等变化；40 Gy组可观察到细胞凋亡变化，见图5。

参考文献

[1] 韩蓝,任庆兰.放射性脑损伤及放射保护剂的研究进展[J].中国医药指南,2013,11(7):77-79.
[2] 郎晓燕,邵国良.放射性脑病的早期影像学特征与诊断[J].医学影像学杂志,2012,22(3):490-493．
[3] 石磊,邵国良.磁共振成像早期诊断放射性脑损伤的研究现状[J].中国药物与临床,2010,10(1):73-74．
[4] 袁文佳,涂彧,崔凤梅.放射性脑损伤的发病机制及治疗[J].国际放射医学核医学杂志,2008,32(4):250-254.
[5] 钟静,姜恩海.放射性脑损伤发病机制及免疫系统改变的研究[J].国际放射医学核医学杂志,2006,30(5):301-304.
[6] 沈海林,纪芳,秦颂兵,等.大鼠全脑照射后早期放射性脑损伤的磁共振波谱与病理对照研究[J].临床放射学杂志,2005,24(9): 818-823.
[7] 肖颂华,段朝晖,沈庆煜,等.VEGF转基因神经干细胞移植对大鼠急性放射性脑损伤后脑组织中NSE表达的影响[J].中国病理生理杂志,2009,25(8):1559-1563．
[8] Rabinov JD, Brisman JL, Cole AJ, et al. MRI changes in the rat hippocampus following proton radiosurgery. Stereotact Funct Neurosurg. 2004;82(4):156-164．
[9] Chan KC, Khong PL, Cheung MM, et al. MRI of late microstructural and metabolic alterations in radiation-induced brain injuries. J Magn Reson Imaging. 2009;29(5): 1013-1020．
[10] Liu Y, Xiao S, Liu J, et al. An Experimental Study of Acute Radiation-Induced Cognitive Dysfunction in a Young Rat Model. AJNR. 2010;31:383-387.
[11] 廉春容.60Co-γ射线全脑照射对血脑屏障通透性的改变和侧脑室室管膜下区神经发生的影响[D].南宁:广西医科大学,2010.
[12] 段琼玉.左卡尼汀对大鼠急性放射性脑损伤后脑组织Caspase-3和Bcl-2表达的影响[D].沈阳:中国医科大学,2012.
[13] 刘运林,张谦,肖颂华,等.全脑照射对迟发性脑损伤大鼠学习记忆能力和海马突触结构的影响,2010,19(10):879-881.
[14] Caceres LG, Aon Bertolino L, Saraceno GE, et al. Hippocampal-related memory deficits and histological damage induced by neonatal ionizing radiation exposure. Role of oxidative status. 2010;1312:67-78.
[15] 马辰莺,徐晓婷,涂彧,等.VEGF mRNA及蛋白在大鼠放射性脑损伤模型中的动态变化[J].中华放射医学与防护杂志,2014,34(6): 405-410.
[16] 孙晨,王凡,王鹏,等.大鼠放射性脑损伤磁共振成像的初步研究[J].中国实验诊断学,2013,17(3):449-452.
[17] 宋琼,夏黎明,王承缘,等.超急性期放射性脑损伤的MRS和DTI研究[J].放射学实践,2007,22(7):687-690.
[18] 陈旺生,李建军.鼻咽癌放射性脑损伤的MR扩散张量成像研究[J].临床放射学杂志,2010,29(6):747-750.
[19] 石磊,郎晓燕,孙晶晶,等.鼻咽癌放疗后放射性脑病早期阶段磁共振成像及磁敏感加权成像表现及其临床意义[J].国药物与临床, 2013,10(1):1256-1258.
[20] 石磊,郎晓燕,孙晶晶,等.鼻咽癌放疗后放射性脑病早期阶段MRI及SWI表现[A].2013年浙江省放射学学术年会论文集[C].2013年.
[21] 陈旺生,李建军,洪澜,等.鼻咽癌放射性脑损伤迟发反应期的磁共振波谱研究[J].临床放射学杂志,2011,30(4):481-484.
[22] 张海博,梁海亁,涂悦,等.放射性脑损伤的研究现状[J].山东医药, 2014, (26):95-97.
[23] 李响.放射性脑损伤的MRS、PWI动物实验研究[D].青岛:青岛大学,2013.
[24] 李建鹏.早期放射性脑损伤动物模型建立、磁共振波谱(1H-MRS)分析与病理对照研究[D].广东:中山大学,2010.
[25] 刘家斌.依达拉奉对急性期放射性脑损伤保护作用实验研究[D].南昌:南昌大学,2010.
[26] 阮林,韦力,廉春蓉,等.全脑照射后血脑屏障改变对放射性脑损伤的影响[J].中国神经精神疾病杂志,2011,37(10):591-595.
[27] 李卉,耿志君,刘学文,等.兔早期放射性脑损伤:1H-MRS与病理对照研究[J].中国医学影像技术,2012,28(12):2117-2121．
[28] Buatti JM, Friedman WA, Theele DP, et al. The lazaroid U74389G protects normal brain from stereotactic radiosurgery-induced radiation injury. Int JRadiat Oncol Biol Phys. 1996;34(3):591.
[29] Miot E, Hoffschir D, Alapetite C, et al. Experimental MR Study of Cerebral Radiation Injury: Quantitative T2 Changes Over Time and Histopathologic Correlation. AJNR. 1995;16:79-85.
[30] 官键,陈龙华,李志勇,等.放射性脑损伤实验兔模型的建立[J].肿瘤防治研究,2007,34(7):477-547.
[31] 邢诒刚,唐亚梅,孙颖,等.急性放射性脑损伤鼠模型的建立[J].中华放射医学与防护杂志,2003,23(4):269-270.

引言

材料方法

1.1 造模动物及材料新西兰兔12只，体质量2.5-2.8 kg，雌雄各半，购自北京市海淀区兴旺动物养殖场，动物生产许可证号：SCXK(京)2006-0006；使用许可证号：SYXK (京)2006-0020，实验阶段均分笼饲养在普通级环境中，温度控制在18-22 ℃，每天给予充足的饲料及清洁饮水。

构建放射性脑损伤兔模型应用的主要仪器：
仪器	来源
磁共振仪	SIEMENS公司
GE lightspeed 4排螺旋CT	GE公司

1.2 造模方法建立放射性脑损伤兔模型，根据预实验结果及文献数据[17-31]，将12只兔随机分为3组，即照射剂量40，80，120 Gy组，每组4只。
麻醉动物：选择速眠新II号和3%戊巴比妥钠两种麻醉剂。首先按0.15 mL/kg肌肉注射速眠新，待动物稳定后经耳缘静脉缓慢注射戊巴比妥钠(剂量1.0 mL/kg)，角膜反射消失且心跳、呼吸正常，视为麻醉成功。动物麻醉后，用8%硫化钠溶液对预照射区域行褪毛处理，褪毛后清水清洁局部皮肤。
模拟定位：在GE lightspeed 4排螺旋CT下模拟定位，实验兔俯卧位固定，下颌与床面平行，以2 mm层厚连续扫描新西兰兔头部。
靶区设定及剂量计算：以右半脑为照射靶区(做半脑对照)，设0°及180°对穿等中心照射野，通过立体定向三维适形放射治疗系统计算得出满足实验照射剂量所需的数据及条件，使94%等剂量曲线包绕100%靶区体积且剂量分布均匀。
靶区照射：照射在西门子PRIMVS直线加速器上进行，采用6 MV X射线行右半脑单次大剂量照射(0°及180°对穿等中心照射)，照射野大小为3 cm×4 cm(光野前后界位于双眼后眦连线与双耳前连线之间，左界位于颅中缝)，源皮距100 cm，兔颅脑表面放置1 cm厚的生物等效膜覆盖照射野，照射剂量分别为40，80，120 Gy。
1.3 造模成功的检测标准颅脑MRI显示T2WI/SWI图像出现异常信号。
1.4 MRI设备及检查方法使用SIEMENS 3.0T磁共振扫描仪(型号：Magretom Verio)，采用临床使用的小关节线圈(LOOP7)作为头部线圈来采集数据。扫描前将实验兔俯卧位固定于检查床上(床面放置厚泡沫板，确保家兔在磁体中心)，LOOP7水平放置于兔脑表面，并用加压带固定，家兔头部及身体两侧使用沙袋固定；新西兰兔使用LOOP7线圈分别行T2WI(T2加权成像)、DTI(弥散张量成像)、MRS(磁共振波普分析)及SWI(磁敏感加权成像)四个序列的多次扫描。分别在照射后第1，3，5，7，10，14天及照射两周后每周定期行MR检查，直至T2WI图像出现异常改变或放疗20周为止。
1.5 MRI扫描参数选择扫描后获得的所有图像均由四名经验丰富的MR诊断医师进行评分，从而确定每个序列的最佳扫描参数。
(1)FSE-T2WI序列：层厚=0.8 mm，距离因子=50%，
TR/TE=750/110 ms，FOV=69 mm×80 mm，采集次数=3，BW=211 Hz，矩阵分辨率=498×640，扫描时间=5：51 min。
(2)1H-MRS 序列：采用点分辨波谱分析法(point resolved spectroscopy，PRESS)及化学位移选择饱和 (chemical-shift selective saturation，CHESS) 水抑制法采集信号。成像参数：TR/TE=2 000/135 ms，采集次数=128，体素大小为10 mm×10 mm×10 mm，BW=1 200Hz，扫描时间=4:24 min (图1A)。
(3)EPI-DTI序列：层厚=2 mm，距离因子=0，TR/TE= 4 906/94 ms， FOV=175 mm×175 mm，b值分别取0、1 000 mm2/s，采集次数=4，弥散方向=20，矩阵分辨率= 256×256，BW=1 260 Hz，扫描时间=7:08 min。
(4)SWI检查：层厚=1.2 mm，距离因子=20%，TR/TE=28/20，FOV=79 mm×180 mm，采集次数=2，BW=120 Hz，扫描时间=7:50 min(图1B)。

1.6 一般观察及组织病理学观察照射后每天观察并记录新西兰兔的日常反应，如摄食、饮水量、自主活动，照射区域毛发情况等。在磁共振图像出现异常改变或放疗20周后时，麻醉实验兔，快速解剖家兔颅脑，进行组织病理学检查(以标记为中心，结合影像学层面数值，进行相同层面病理切片)，根据需要对病理图像进行分析。
主要观察指标：各组影像学检查结果，脑组织形态观察结果。实验动物的筛查选入由2名经验丰富的动物饲养管理师分别筛查记录，最后达成一致。影像资料由2名有经验的医师共同阅片评估，分析并记病灶形态、大小、分布、位置以及排除非病变干扰等。

讨论

目前，临床诊断放射性脑损伤主要是依据T2WI上的异常信号与放疗范围的统一，但当T2WI出现信号异常往往提示病变已进入不可逆阶段，临床干预效果甚微，严重影响患者预后，因此早期诊断并在疾病早期阶段积极干预，意义十分重大。近年来，对MRI早期诊断放射性脑损伤的研究越来越多，尤其是动物实验研究更是其中的热点^{[6-16，23-31]}。但以往的动物模型大多数以大鼠作为对象^[6-16]，且多以全脑作为放射靶区，失去了自身对照的意义。另外，大鼠脑组织较小，常规MRI线圈难以获得较满意的图像，且限于直线加速器设备的不足，半脑照射会累积周围其他组织器官，影响放射后的生存，而且大鼠对麻醉剂不够耐受，所以笔者认为大鼠不适用于放射性脑损伤长期的定性研究。
实验选择家兔为实验对象，通过右半脑精确等中心照射建立动物模型，作者认为其优势及意义如下：①兔脑解剖结构、大小均比大鼠更适合定位，实施更加精确的照射，如内囊前肢或海马，进一步探讨不同结构的放射反应。②兔脑解剖及大小更适合MRI检查，应用临床常规表面线圈就能获得满意图像，不需要购买昂贵的专用动物线圈，节约了成本，有利于研究方法的广泛推广和应用。③0°及180°对穿等中心照射，能保证整个照射区域剂量相同，避免不同深度脑组织接受剂量不同，从而利于MRI对组织反应的观察。
实验采用半脑照射，照射野取在双眼后眦连线至双耳前连线之间，避开了眼球和口腔，一来建立了自身对照组，提高了实验动物生存率；二来可保证照射后动物的正常摄食、饮水，使实验能持续进展。另外，为了抵消建成效应，放疗时在实验动物头颅表面以1 cm的生物等效膜覆盖，使脑组织处在剂量分布比较均匀且较高的范围内。
实验中120 Gy组的4只动物均表现出了明显的神经损害体征，并且有典型的MR表现与相应的放射性脑病病理改变，主要表现为神经胶质细胞的变性坏死和脱髓鞘，支持了放射性脑损伤的神经胶质损伤学说。80 Gy组实验动物首先表现为放疗侧脑室的扩大，逐渐累积脑室周围白质。40 Gy组其中1只出现硬膜下出血，是否有放射性损伤有关需要进一步的验证。另外，有1只兔在放疗晚期出现了放射性白内障，这可能与麻醉失败、放疗过程中兔子移位，致使眼球受到照射有关，也可能与散射线有关，这提示实验在以后的放疗过程中要尽量保护对辐射敏感的照射野以外的组织。80及120 Gy组新西兰兔均成功建立了放射性脑损伤模型。
迄今为止，与磁共振有关的动物实验中较少提及具体的MRI扫描参数且缺乏统一的标准，使用小关节线圈LOOP7的研究也鲜有报道，实验使用LOOP7线圈制定了家兔头颅MRI检查的扫描参数，为以后动物实验的广泛开展及应用提供依据。LOOP7线圈为直径7 cm大小的环形小关节线圈，其分辨率比头颅正交线圈高，能完全覆盖实验兔的脑组织，且能较好的简单固定在家兔头颅表面，使家兔头颅处于比较均匀的磁场中。
总之，应用立体定向三维适形放射治疗计划系统，采用6 MV X射线对新西兰兔行右侧半脑单次大剂量照射能够成功建立放射性脑损伤动物模型，并且该模型适合临床常规线圈的磁共振检查，为进一步深入研究放射性脑损伤的早期MRI诊断提供基础，为以后动物实验的广泛推广提供依据。