肝损伤大鼠血清诱导培养脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.23.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：脐带间充质干细胞来源于新生个体脐带组织，来源广泛，无社会伦理学因素制约，有望代替骨髓间充质干细胞成为细胞移植和再生医学的理想种子细胞。
目的：探讨肝衰竭大鼠血清对人脐带间充质干细胞肝向诱导分化作用，为临床上利用脐带间充质干细胞治疗终末期肝病提供实验依据。
方法：腹腔注射10%四氯化碳溶液建立急性肝损伤大鼠模型，对照组腹腔注射等剂量的大豆油，48 h后腹主动脉取血离心分离血清。取第3代人脐带间充质干细胞，分别用体积分数为20%肝损伤大鼠血清和体积分数为20%胎牛血清诱导培养，观察诱导前后人脐带间充质干细胞形态学改变，检测培养液上清甲胎蛋白、白蛋白水平。
结果与结论：肝损伤大鼠血清培养第1天细胞形态变化不大，呈梭形，仍呈编织状或漩涡状生长，第2天细胞呈短梭形，第3天细胞呈类圆形，第4天呈圆形，并有极少量细胞漂浮。肝损伤大鼠血清培养人脐带间充质干细胞4 d，其上清液白蛋白水平较诱导前和对照组均有升高趋势(P < 0.001)，甲胎蛋白水平无明显变化。结果表明肝损伤大鼠血清可使脐带间充质干细胞向肝样细胞分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 肝样细胞, 脐带间充质干细胞, 肝损伤, 血清, 诱导分化

Abstract:

BACKGROUND: Umbilical cord mesenchymal stem cells are from the umbilical cord of newly born individuals and have no ethical issues, and therefore are promising candidates for seeded cells as a substitute for cell transplantation and regenerative medicine.
OBJECTIVE: To investigate the effects of serum from liver injury rats on induced differentiation of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells and provide experimental evidence for use of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the treatment of patients with end-stage liver disease in the clinic.
METHODS: Rat models of acute liver injury were established by intraperitoneal injection of 10% carbon tetrachloride. Rats in the control group were intraperitoneally administered the same amount of soybean oil. Forty-eight hours after modeling, abdominal aorta blood was taken for serum preparation. Passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells were cultured with 20% serum from liver injury rats and 20% fetal bovine serum. Morphology of human umbilical cord mesenchymal stem cells was observed before and after culture. Levels of α-fetoprotein and albumin in the supernatant were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: Cells exhibited shuttle-shaped appearance and grew in whirlpool-like manner at 1 day after culture with serum from liver injury rats, exhibited short shuttle-shaped appearance at 2 days, were oval-shaped at 3 days, and were round and an extremely small number of cells were floated at 4 days. At 4 days after culture with serum from liver injury rats, level of albumin in the cell supernatant was significantly increased than that before induction and that in the control group (P < 0.001), and there was no significant difference in level of α-fetoprotein in the cell supernatant. These results suggest that serum of liver injury rats can induce differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells.

中图分类号:

R394.2

钟艳，唐晓鹏. 肝损伤大鼠血清诱导培养脐带间充质干细胞向肝样细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(23): 3644-3651.

Zhong Yan, Tang Xiao-peng . Serum from liver injury rats induces differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocyte-like cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(23): 3644-3651.

图/表（结果） 5

2.1 脐带间充质干细胞形态经过胶原酶消化获得的有核细胞以5×104/cm2接种于35 mm培养皿，原代细胞两三天贴壁(图1)，倒置显微镜下可见贴壁细胞呈短梭形，六七天后生长速度加快，细胞呈梭形，表现为编织状或漩涡状生长，2周可达到80%融合(图2)，复苏的细胞培养1 d贴壁，1周可铺满整个培养皿，生长速度较原代快，细胞形态未见明显改变。

2.2 流式细胞仪分析脐带间充质干细胞免疫表型经流式细胞仪检测第3代脐带间充质干细胞表达CD73、CD105等间充质干细胞标记，不表达CD34、CD45等造血细胞标记(图3)。

2.3 脐带间充质干细胞体外成脂及成骨诱导分化能力第3代脐带间充质干细胞成脂定向诱导23 d后，未加成脂诱导剂的对照组细胞油红O染色阴性，加入成脂诱导剂的实验组细胞油红O染色强阳性，大部分细胞中可见红色的脂肪空泡。第3代脐带间充质干细胞成骨定向诱导21 d后，未加成骨诱导剂的对照组茜素红染色阴性，加入成骨诱导剂的实验组细胞茜素红染色阳性，可见细胞间有黑色颗粒沉积，颗粒大小不等，形态不一，提示有黑色矿物质沉积，见图4。

2.4 两组大鼠一般情况变化 48 h内两组SD大鼠均无死亡。两组大鼠体质量变化小于10 g。对照组毛色灰白发亮，实验组毛色暗淡。对照组进食量、饮水量无变化，实验组进食量、饮水量稍减少。对照组反应敏捷，实验组活动量减少，反应迟钝。
2.5 肝功能变化由表1可见，造模后48 h实验组血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶活性有上升趋向，与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.6 肝组织病理变化实验组肝脏大体观：肝脏体积稍变小，呈暗红色，质地软，边缘变锐利；光镜下可见肝窦结
构消失，肝细胞脂肪变性、灶状坏死，坏死的肝细胞分解，胞浆呈空泡样变，细胞核固缩、碎裂或溶解，肝细胞间及汇管区可见少量炎性细胞浸润。对照组肝脏体积无明显变化，呈鲜红色，质地极软，边缘钝，光镜下见肝组织结构清晰，无细胞水肿、变性及坏死，无炎性细胞浸润，见图5。
2.7 脐带间充质干细胞肝向诱导分化
2.7.1 细胞形态变化诱导第1天细胞形态变化不大，呈梭形，仍呈编织状或漩涡状生长，第2天细胞呈短梭形，第3天细胞呈类圆形，第4天呈圆形，并有极少量细胞漂浮(图6)。
2.7.2 诱导后上清液白蛋白、甲胎蛋白水平由表2可见，肝诱导实验组上清白蛋白有升高趋势，差异有显著性意义(P < 0.01)。甲胎蛋白无明显变化。

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引言

肝病是临床上的多发病和常见病，死亡率极高，初步估计每年约有两百万人死亡。肝脏具有强大的再生能力，肝损伤发生后，在肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子α和肝素结合表皮生长因子的刺激下启动肝脏再生过程，但在终末期肝病阶段它不能自行恢复受损的组织。在欧洲各国引起肝病的原因以过度饮酒及药物性损伤为主。在中国引起该病最常见的原因为病毒性肝炎，由此导致的肝衰竭病死率极高，至少达到50%，其中爆发性肝衰竭病死率可达到90%以上。随着生活节奏的变化，由药物、乙醇、妊娠期急性脂肪肝等原因所致的肝衰竭发病率呈上升趋势。
现阶段肝衰竭的治疗方式包括一般常规支持治疗、免疫调节治疗、促肝细胞生长、人工肝支持治疗及肝移植。肝移植被证明是目前治疗肝衰竭最有效的方式，但是供者缺乏、免疫排异药物的终生使用、治疗费用高昂等因素是制约这项治疗手段发展应用的巨大障碍。为寻求更快捷、更方便、更经济可行的治疗方式，细胞移植以替代肝移植的潜在发展趋势进入医学界视野。对于细胞种类的选择，肝细胞一度被认为是最有前景的细胞，但是肝细胞是高度分化的细胞，正常情况下很难被分离出来，用于移植的肝细胞数量暂时得不到满足。干细胞具有增殖迅速、多向分化潜能，目前的体内及体外实验都证明其能分化成肝样细胞，故在治疗肝衰竭方面的临床价值不容忽视。
干细胞依据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞增殖速度快，拥有完美的分化为机体全部组织器官的能力，可作为干细胞移植最理想的种子细胞，但是社会伦理道德的争议及致瘤性风险使人类胚胎干细胞的研究受阻。成体干细胞中研究最多、应用最频繁的是骨髓干细胞。美国华盛顿大学的多纳尔、托马斯早在1957年就将骨髓移植到患者体内，用于治疗造血功能障碍疾病，但是骨髓干细胞的获取方式不可避免地对供者造成创伤，可获得的干细胞数量随着年龄增长而减少，病毒感染风险也随着年龄增长而增加。因此大家将目光投向非骨髓来源的成体干细胞，随后从脂肪组织、肌肉、胰腺、胎盘、羊水、脐带、脐血等组织中分离出干细胞[1-7]。脐带间充质干细胞以其取材方便、来源广泛、免疫抑制、支持造血及多项分化潜能等特点受到了研究者的青睐[8-13]。
很多研究表明来自不同部位的成体干细胞能够在体外分化成为肝样细胞。骨髓干细胞在添加了肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、制瘤素M和一些化学物质如尼克酰胺、地塞米松、胰岛素等的培养基诱导下可分化为肝样细胞[14-15]。任红英等[16]研究脐带间充质干细胞多年，发现人脐带间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子和制瘤素M作用下，也可以分化为肝样细胞。实际上，单独使用肝细胞生长因子也可使干细胞成功向肝样细胞分化。然而，在实际临床应用过程中，用上述诱导剂进行肝向诱导分化可行性不大，因为这样不仅会增加细菌或内毒素污染机会，而且肝细胞生长因子等细胞因子的量也难以掌握。因此，患者体内自然产生的肝细胞生长因子才是最理想的诱导剂。有研究表明，肝衰竭、心力衰竭致缺血缺氧性肝损伤血清可使骨髓干细胞向肝样细胞分化。本实验主要评估肝衰竭血清对脐带间充质干细胞在肝向分化过程中的影响。
关于肝损伤模型的建立，前人进行了多年的探索。早在1989年，Rao等[17]应用四氯化碳建立肝损伤模型，初步阐明了四氯化碳能够抑制肝细胞增殖，加快肝损伤过程最终导致肝衰竭。现在制备急性肝损伤动物模型还可使用 D-半乳糖苷[18]、对乙酰氨基酚[19]、二甲基亚硝胺及抗结核药等[20-21]。然而四氯化碳无疑是应用最广泛和最成熟的，它引起肝损伤的毒性机制包括：①引起氧化应激。四氯化碳经肝脏微粒体Cytp450活化产生大量自由基，改变细胞膜通透性及流动性。②改变细胞因子的活性。四氯化碳引起机体产生脂质过氧化物，后者可引起高表达肿瘤坏死因子α、转化生长因子β1和白细胞介素等细胞因子，这些细胞因子参与四氯化碳引起的肝硬化过程。③引起细胞凋亡。目前认为是通过激活死亡受体或核因子κB使该过程得以实现。④毒性基因组变化。在四氯化碳急性肝损伤过程中，损伤相关基因可能多达179个。四氯化碳致慢性肝损伤过程中，149个基因被认为与肝纤维化相关。急性肝损伤实验表明，6-24 h系肝损伤阶段，48 h至2周是机体自我修复阶段。本实验以腹腔注射四氯化碳48 h后取大鼠血清作为脐带间充质干细胞肝向诱导原材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

设计：随机对照动物实验及细胞学体外实验。
时间及地点：实验于2012年9月至2014年1月在中南大学湘雅二医院实验中心完成。
材料：
实验动物：清洁级健康成年SD大鼠14只，雌雄各半，体质量(260±20) g，由湖南省人民医院动物实验中心提供，分笼饲养，每笼7只。饲养条件：相对湿度55%-60%，室内温度24-27 ℃。
主要试剂：分析纯四氯化碳(纯度99.99%)购自湖南师大化学试剂厂。体积分数为40%甲醛溶液购自湖南师大化学试剂厂。
10%四氯化碳溶液：用大豆油稀释至10%体积百分比备用，现配现用。
体积分数为10%中性甲醛溶液：体积分数为40%甲醛溶液与蒸馏水以1︰9的体积比配制而成。
主要仪器：石蜡切片机(德国Leica公司)，202-0型电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)，TG16-WS台式低速离心机(湘仪公司)，超净工作台(江苏安泰公司)，倒置光学显微镜(Olympus公司)。
实验方法：
人脐带间充质干细胞的分离、培养：①签署知情同意书后，在无菌条件下剪取新鲜脐带组织，放入到加有双抗的PBS无菌溶液中冷藏转运。6 h内进行下一步处理。②用眼科剪把脐带剪成2 cm左右的小块，充分洗去黏附的血液。③小心剔除脐动脉、脐静脉及脐带表面包膜。④剪碎脐带组织，加入0.2%胶原酶Ⅱ溶液，37 ℃振荡消化3 h。⑤用100目及200目滤网过滤，去除未被消化的组织团块。⑥加入PBS以1︰5比例稀释消化液，2 000 r/min离心 20 min，共2次，收集管底沉积细胞。⑦以5×104/cm2接种于35 mm培养皿，置于体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养，记为原代细胞，3 d后换培养液，去除未贴壁的杂细胞，以后每隔2 d换液1次。人脐带间充质干细胞基础培养基成分：DMEM-LG、体积分数为10%胎牛血清和100 U双抗。⑧细胞达到80%-90%融合时，用0.25%胰酶37 ℃消化2.5 min，以5×103/cm2传代扩增。原代细胞以1︰1的比例进行传代培养，记为第1代，第2代后按照1︰2比例传代。第3-5代间充质干细胞冻存在液氮罐中备用。
人脐带间充质干细胞形态学观察：取生长状态良好的原代、第1代、第2代、第3代间充质干细胞进行观察，在倒置显微镜下观察细胞形态特点。
人脐带间充质干细胞的冻存及复苏：
细胞冻存：取对数生长期的细胞，经0.25%胰酶消化、离心，加入1 mL冻存液，吹打成单细胞悬液，细胞浓度约为1×108 L-1，移至无菌冻存管，密封标记后放入程序降温盒置-70 ℃冰箱过夜，第2天移入液氮罐冻存。
细胞复苏：将冻存的人脐带间充质干细胞从液氮罐中取出，37 ℃水浴快速融化，乙醇消毒冻存管，用吸管移至无菌离心管中，加入9 mL PBS稀释，颠倒混匀，500 r/min水平离心10 min，去掉上清，加入1 mL基础培养基，吹打为单细胞悬液，移入35 mm培养皿，放入体积分数为5%CO2、37 ℃培养箱中培养，24 h后更换基础培养基。
流式分析人脐带间充质干细胞免疫表型：用单色免疫荧光标记法直接检测。第3代脐带间充质干细胞经胰酶消化后，PBS充分洗涤2次，加入PE标记的抗CD73、CD105和FITC标记的抗CD34、CD45单克隆抗体，4 ℃孵育30 min。随后PBS洗涤细胞3遍，悬浮在500 μL PBS中待上机检测，设空白对照组。
人脐带间充质干细胞成脂及成骨诱导分化：多项实验证明脐带间充质干细胞在相关诱导剂作用下，能分别向脂肪细胞及骨细胞分化，以基础培养基中的细胞为对照。
成脂诱导分化：①第2代细胞达到80%-90%融合时，胰酶消化，以2×104/cm2接种于6孔板，加入基础培养基置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养。每3 d换液1次。②细胞达80%-90%融合后将培养基更换为成脂诱导剂A，3 d后更换为成脂诱导剂B维持诱导。③24 h后将培养基更换为成脂诱导剂A。④重复进行上述循环4次。⑤丢弃6孔板中上清，以成脂诱导剂B培养细胞7 d。⑥丢弃培养基废液，PBS洗涤1遍，体积分数为10%中性甲醛溶液固定 30 min。⑦PBS洗涤2遍，6孔板每孔加入1 mL油红O溶液，持续30 min。⑧PBS洗3遍，光学显微镜下观察并摄像。
成骨诱导分化：①6孔板每孔加入0.1%明胶溶液2 mL，室温下静置30 min，吸弃明胶溶液，静置20-30 min使孔底干燥，盖上培养板盖子，备用。上述过程在超净工作台进行。②第2代细胞达到80%-90%融合时，胰酶消化，以3×103/cm2接种于明胶包被的6孔板。③24 h后将培养基更换为成骨诱导剂，每3 d换液1次。④3周后丢弃培养基废液，PBS洗涤1遍，体积分数为10%中性甲醛溶液固定30 min。⑤PBS洗涤2遍，6孔板每孔加入1 mL茜素红溶液，持续 3-5 min。⑥PBS洗3遍，光学显微镜下观察并摄像。
实验动物分组：14只SD大鼠随机分为2组，实验组和对照组各7只。
四氯化碳肝损伤模型的建立：实验组用已配好的10%四氯化碳腹腔注射，注射量为9 mL/kg，对照组一次性注射大豆油9 mL/kg。仔细观察并记录大鼠的一般情况变化，包括体质量与毛色变化情况、食欲及饮水情况、对周围刺激的应变能力等。
大鼠血清制备：两组SD大鼠均于腹腔注射化学试剂后48 h腹主动脉取血约8 mL，室温静置半小时后以4 000 r/min离心分离血清，取适量送检验科查丙氨酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶活性，余血清-70 ℃分装储存备用。
肝组织苏木精-伊红染色过程：取血后立即以颈椎脱臼法处死全部大鼠，大体观察肝脏变化情况。①组织固定：剪开腹腔，分别取2.0 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肝组织块，生理盐水清洗后置于体积分数为10%甲溶固定液中浸泡24 h。②组织脱水：依次在不同体积分数乙醇中(70%→80%→85%→90%→95%→95%→100%→100%)浸泡脱水，每级持续时间15 min。③组织透明：肝组织块浸于二甲苯溶液中，持续10 min，共2次。④组织浸蜡：肝组织浸于石蜡溶液中，56 ℃过夜。⑤包埋：将石蜡溶液倒入模型中冷却、晾干。⑥切片：蜡块冰冻后切片，切片厚约3 mm。⑦黏片：切片放到载玻片上，编号。白片制作完成。⑧脱蜡至水：把白片置于56 ℃电热恒温干燥箱过夜，取出后放入二甲苯 15 min，依次在不同体积分数乙醇中(100%→100%→95%→95%→90%→80%→70%)浸泡，每级持续时间3 min。⑨苏木精-伊红染色：充分水洗，盐酸乙醇洗一下，再次水洗。56 ℃温水返蓝，伊红浸泡1 min，蒸馏水洗净，在不同体积分数乙醇缸中(70%→80%→90%→95%→95%→100%→100%)和二甲苯中洗一下脱水，以中性树脂封固。
脐带间充质干细胞肝向诱导：
肝诱导实验组培养基：四氯化碳肝损伤大鼠血清加入DMEM-LG培养基内，加入100 U青链霉素，配成含体积分数为20%肝损伤大鼠血清的DMEM培养基。
肝诱导对照组培养基：胎牛血清加入到DMEM-LG培养基，加入100 U青链霉素，配成含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基。
肝向诱导：第3代脐带间充质干细胞达80%-90%融合后将培养基分别更换为肝诱导实验组培养基及肝诱导对照组培养基，每3 d换液1次，共诱导2周。
细胞形态变化：倒置显微镜观察实验组及对照组形态学改变并拍照。
培养基上清白蛋白、甲胎蛋白检测：分别收集诱导前培养基上清、实验组诱导后培养基上清及对照组上清送湘雅二医院检验科检测白蛋白、甲胎蛋白值。
主要观察指标：①脐带间充质干细胞形态、免疫表型、成脂及成骨诱导分化能力。②SD大鼠造模后血清丙氨酸转氨酶、天冬氨酸氨基转移酶活性以及肝组织病理形态。③脐带间充质干细胞肝向诱导分化后细胞形态，上清液白蛋白、甲胎蛋白水平。
统计学分析：实验结果用SPSS 19.0统计软件进行t 检验分析。以P < 0.05或P < 0.01作为判断差异有显著性意义的标准。

讨论

从脐带组织中能够成功分离、提取出脐带间充质干细胞，经流式鉴定可以表达间充质干细胞表面标记，不表达造血干细胞标记，经成脂、成骨诱导剂诱导21 d左右可以向脂肪细胞、骨细胞分化。还有文章报道人脐带间充质干细胞也可向肌细胞、胰岛分泌细胞、血管内皮细胞、心肌细胞和肝样细胞等体细胞分化。显而易见，人脐带间充质干细胞具备多向分化潜能，其跨胚层肝向分化潜能使其在肝病治疗领域有可能大有作为。
脐带间充质干细胞具有多向分化潜能，但是具体分化过程受到所处微环境的影响。翻阅了有关人脐带间充质干细胞对肝损伤影响的文献后发现，人脐带间充质干细胞对各种类型的急慢性肝损伤均有修复作用。Zhang等[22]研究提示将人脐带间充质干细胞移植到四氯化碳所致肝损伤的免疫缺陷小鼠体内，在肝组织中可检测到人脐带间充质干细胞存在，并分化为肝样细胞，同时移植组小鼠体内的全身炎症因子水平明显降低。Zhang等[23]把人脐带间充质干细胞悬液注入30例乙肝肝硬化失代偿期患者体内，腹水明显减少，生化检测结果提示白蛋白量及胆碱酯酶活性明显增加，凝血功能得以改善。任红英等[16]研究发现人脐带间充质干细胞在肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子和制瘤素M诱导下，也可以分化为肝样细胞，可见人脐带间充质干细胞对肝损伤的修复功能及肝向分化潜能是确定的，其具体机制目前暂不十分明确。
机体内环境的稳定对维持机体正常功能至关重要。机体是一个整体，平时可通过神经、体液调节维持机体内环境稳定。正常肝细胞进行分裂活动是极少见的，一旦肝损伤发生，机体可产生一系列促炎及抗炎细胞因子，血液中促进肝细胞再生的激素、细胞因子及其他的调节因子发生显著改变，肝脏再生过程也在这些因子的刺激下启动。近年来研究表明，肝功能损伤时肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素18、Fas配体等细胞因子水平升高，并与肝损伤炎症程度呈正比。上述细胞因子可直接导致肝细胞凋亡，也可促进中性粒细胞聚集释放氧自由基或蛋白酶造成肝损伤，具体机制暂不十分清楚。同时，机体肝脏面对炎症细胞及炎症因子破坏作用时，也可分泌促进肝细胞再生的细胞因子。研究证实肝衰竭患者血清里存在对肝脏发育及再生起作用的细胞因子如肝细胞生长因子及干细胞生长因子等都高于正常值。研究人员检测病毒性肝炎、肝硬化、肝衰竭和心衰致缺血缺氧性肝损伤患者血清，发现肝细胞生长因子水平明显升高[24]。Bishi等[24]检测了25例急性肝衰竭患儿体内肝细胞生长因子和血管内皮细胞生长因子水平，发现肝细胞生长因子较对照组明显升高，而血管内皮细胞生长因子升高不明显。肝细胞生长因子合成增高可能与残存肝细胞的代偿性分泌增多相关，也可能与肝细胞生长因子灭活降低有关。肝损伤机体血清中肝细胞生长因子水平增高，可以猜测肝细胞生长因子在促进肝脏修复及再生过程中起着关键作用。
肝损伤时各种细胞因子在肝脏再生过程中起着不同的作用[25]。肝细胞生长因子、表皮生长因子、肿瘤坏死因子α、血管内皮细胞生长因子都被认为是完整的有丝分裂原，每一种都能单独刺激肝细胞DNA合成，胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素和去甲肾上腺素可起协同作用刺激肝细胞DNA合成，但不能单独刺激DNA合成[26]。显而易见，单靠一种物质是不能完成上述DNA合成过程的。肝细胞生长因子由非实质肝细胞合成，是首次发现的血源性有丝分裂原和DNA合成的强效诱导剂和调节剂，在促进细胞再生过程中起着至关重要的作用。肝细胞生长因子可通过上调其他生长因子水平发挥其在肝脏再生中的有丝分裂作用。转化生长因子β1、γ-干扰素、肿瘤坏死因子和脂多糖通过一氧化氮合酶介导过程对肝细胞再生起抑制作用。肿瘤坏死因子和白细胞介素6启动肝细胞的再生，它们既可诱导肝细胞死亡，又可促进肝细胞再生。当肝细胞自我修复无法完成，肝干细胞及骨髓干细胞被动员分化为肝细胞参与肝组织修复，但是这一过程效率低下且无法进行监测。由此可见，外源性干细胞移植无疑可以参与肝损伤修复。
本实验诱导脐带间充质干细胞向肝样细胞分化采用的是四氯化碳致肝损伤大鼠血清。现在一般常用的肝毒剂包括四氯化碳、D-半乳糖胺和对乙酰氨基酚等。此次采用腹腔注射四氯化碳诱导急性肝衰竭的目的在于：腹腔注射方便快捷，处理时间极短，48 h足够建立急性肝损伤模型，四氯化碳的作用靶器官主要是肝脏，对其他组织器官造成的毒性作用较小。
实验采用20%肝衰竭大鼠血清诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化后可以表达白蛋白，提示此类细胞具有类肝细胞功能。白蛋白是肝细胞系较为特异性的指标，也是最可靠和最常用的检测肝功能的指标，因为肝细胞合成白蛋白最多，其他组织细胞分泌很少。肝衰竭大鼠血清诱导人脐带间充质干细胞向肝样细胞分化，可能与肝衰竭大鼠血清中存在的适宜肝细胞生长的激素、细胞因子和其他调节因子有关，但肝损伤时分泌的细胞因子众多，具体是哪些物质起作用暂不十分清楚。
将人脐带间充质干细胞移植入肝衰竭动物模型或人体后，它的旁分泌作用也参与对肝功能的修复。人脐带间充质干细胞自身也可以分泌生长因子和血管生成因子，促进肝损伤的修复。在未来的研究领域里，需要进一步研究人脐带间充质干细胞对肝损伤修复作用的机制，还需要明确究竟是直接把人脐带间充质干细胞移植到肝损伤个体内对肝功能修复有利，还是将人脐带间充质干细胞诱导成肝样细胞或采用反转录病毒转导肝细胞生长因子基因到人脐带间充质干细胞内促使其向肝样细胞分化后再将其移植到肝损伤个体对肝功能修复更有利，这需要进一步的实验研究证实。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程