两种人工合成骨形态发生蛋白活性多肽的骨诱导能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.21.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：根据骨形态发生蛋白氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区，课题组采用人工固态合成法合成了骨形态发生蛋白活性多肽Ⅰ与骨形态发生蛋白活性多肽Ⅱ。
目的：初步评价骨形态发生蛋白多肽Ⅰ和骨形态发生蛋白活性多肽Ⅱ在动物体内的骨诱导能力。
方法：将42只SD大鼠随机均分为7组，分别在臀部肌肉内植入载0.2，0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ的羟基磷灰石/聚乳酸材料、载0.2，0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅱ的羟基磷灰石/聚乳酸材料及羟基磷灰石/聚乳酸材料。植入后3，5周进行X射线、CT及组织学检测，观察7组成骨情况。
结果与结论：载骨形态发生蛋白多肽羟基磷灰石/聚乳酸材料植入后3，5周的局部成骨均高于羟基磷灰石/聚乳酸材料组，说明两种多肽均具有一定的诱导成骨能力，且随着时间的增长效果更强；植入5周后，载0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ组成骨效果高于载0.2 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ组、载0.2，0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅱ组(P < 0.05)；载0.4 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ组与载0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ组成骨效果无差异，表明骨形态发生蛋白多肽Ⅰ的诱导成骨能力强于骨形态发生蛋白多肽Ⅱ。

关键词: 生物材料, 材料相容性, 骨形态发生蛋白, 活性多肽, 骨诱导, 骨修复材料, 羟基磷灰石, 聚乳酸

Abstract:

BACKGROUND: According to the core functional zone of amino acid sequence of the osteoinduction in bone morphogenetic proteins, our research group synthesized bone morphogenetic protein (BMP) active polypeptides I and II by artificial solid-state synthesis method.
OBJECTIVE: To evaluate the osteoinductive ability of BMP active polypeptides I and II in animals.
METHODS: Forty-two Sprague-Dawley rats were randomly divided into seven groups, and respectively implanted with hydroxyapatite/polylactic acid carrying 0.2, 0.4, 0.8 g/L BMP active polypeptides I, hydroxyapatite/polylactic acid carrying 0.2, 0.4, 0.8 g/L BMP active polypeptides II, and hydroxyapatite/polylactic acid alone. At 3 and 5 weeks postoperatively, X-ray, CT and histological detection were conducted to evaluate osteoinductive conditions in the seven groups.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3 and 5 weeks postoperatively, there were better local osteoinductive effects in the groups hydroxyapatite/polylactic acid carrying BMP active polypeptides I and II than the group of hydroxyapatite/polylactic acid, indicating both two kinds of BMP active polypeptides possessed a certain
osteoinductive ability. Moreover, this osteoinductive ability became stronger with time. At 5 weeks postoperatively, the osteoinductive effect in the 0.4 and 0.8 g/L BMP active polypeptides I groups was better than that in the 0.2 g/L BMP active polypeptides I group and the 0.2, 0.4 and 0.8 BMP active polypeptides II groups (P < 0.05). In addition, there was no difference in the osteoinductive effect of 0.4 and 0.8 g/L BMP active polypeptides I groups. These results indicate that BMP active polypeptides I has a stronger osteoinductive ability than BMP active polypeptides II.

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 9

2.1 实验动物一般情况及大体观察所有动物均顺利完成手术，术后观察期间，动物饮食、活动良好，各组实验动物伤口无肿胀，无脓性渗出，伤口愈合良好，全部存活。植入材料各组臀部硬度均增加。
2.2 X射线及CT成像观察结果植入后不同时间点成像结果见图1-4。
植入后3周，各组植入区X射线检查均无明显显影；5周时，X射线中0.2 g/L多肽Ⅰ组植入区内有较浅可疑显影(图1D)，0.4 g/L多肽Ⅰ组有较浅较大显影，0.6 g/L多肽Ⅰ组显影较明显(图1E，F)， CT复查未见0.2 g/L多肽Ⅰ组显影(图4C)，而0.4 g/L多肽Ⅰ组、0.6 g/L多肽Ⅰ组显影明显(图4D，E)；5周时，X射线下0.2 g/L多肽Ⅱ组未见明显显影(图2D)，0.4 g/L多肽Ⅱ、0.6 g/L多肽Ⅱ组可见大块状较浅显影(图2E，F)，CT复查可见3组存在高密度显影明显(图4F-H)。而对照组植入3，5周植入区X射线均未见明显显影，5周CT复查仍未见低密度显影(图3，图4B)；为排除框架材料羟基磷灰石对影像学的影响，将框架材料在体外与大鼠尾骨做对比进行CT照射，骨窗下可见极低密度显影，因此对实验影响不大(图4A)。

2.3 组织学切片观察结果
苏木精-伊红染色：组织切片观察显示植入3周后，各组都少有新骨形成，电镜下可见大量细胞长入多孔材料，贴附于孔壁。随着植入时间的延长，材料周围软骨细胞活跃，材料逐渐降解。5周时各组材料部分降解，0.2，0.4，0.6 g/L多肽Ⅰ组有较多软骨基质形成；0.2，0.4，0.6 g/L多肽Ⅱ组分泌软骨基质情况不如相对应的0.2，0.4，0.6 g/L多肽Ⅰ组，仅有少量软骨细胞形成，软骨基质形成；对照组5周材料降解多于各实验组，但只有极少量类似软骨基质物形成，有少量软骨细胞形成(图5-7)。

Masson染色：为明确材料周围软骨基质分泌及成骨情况，植入后3周，0.2 g/L多肽Ⅰ组在降解材料周围仅有少量软骨胶原形成，表现为蓝色；0.4，0.6 g/L多肽Ⅰ组软骨胶原面积明显多于0.2 g/L多肽Ⅰ组(蓝色)，可见少许红染；0.2，0.4，0.6 g/L多肽Ⅱ组均有少量软骨胶原形成(蓝色)。5周时，各实验组软骨胶原(蓝色)面积明显多于3周，周围少量红染，且0.4，0.6 g/L多肽Ⅰ组下软骨胶原面积明显高于0.2 g/L多肽Ⅰ组。对照组植入3，5周蓝色软骨胶原较少，但5周较3周有增加(图8-10)。 2.4 Manson染色等级统计学分析 Masson染色可以显著区分胶原和其余组织[6-8]。通过一个评分系统进一步对各组在成骨胶原分泌旺盛时(5周)骨诱导活性进行组织学评分[5]，0.2，0.4，0.6多肽Ⅰ组、0.2，0.4，0.6多肽Ⅱ组与对照组评分分别为0.555±0.274，2.555±0.274，2.723± 0.252，0.555±0.274，2.055±0.248，2.388±0.253，0.222± 0.273，将其评分结果进行非参数秩和平均等级两两比较，除0.2 g/L多肽Ⅰ组与0.2 g/L多肽Ⅱ组、0.4 g/L多肽Ⅰ组与0.6 g/L多肽Ⅰ组、0.4 g/L多肽Ⅰ组与0.6 g/L多肽Ⅱ组比较差异无显著性意义外，其余组间两两比较差异均有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)。

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引言

材料方法

设计：随机分组动物体内实验。
时间及地点：于2014年3至6月在解放军总医院第一附属医院骨科实验室及动物实验中心完成。
材料：
羟基磷灰石/聚乳酸框架材料：由北京博恩康生物科技有限公司提供，材料孔隙率为80%，平均孔径120 µm，表观密度为0.74 g/cm3，压缩强度为1 MPa。无菌条件下将框架材料切成直径4 mm、厚约1.5 mm的圆片，用60Co照射(25 kGy)消毒。
骨形态发生蛋白多肽Ⅰ与骨形态发生蛋白多肽Ⅱ：由北京博恩康生物科技有限公司提供。根据骨形态发生蛋白2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区段(20个氨基酸)，通过FMOC/tBu固相多肽合成法合成含20多个氨基酸的寡肽活性多肽，并根据活性多肽的氨基酸排列和个数不同分为骨形态发生蛋白多肽Ⅰ与骨形态发生蛋白多肽Ⅱ。
实验动物：8周龄雄性SD大鼠42只，体质量200-250 g，由解放军总医院第一附属医院实验动物中心提供，许可证号：SYXK(军)2012-0014。
主要试剂与设备：戊巴比妥钠(美国Sigma)；苏木精、伊红(北京化学试剂公司)；改良Masson三色染色试剂盒(Leagene)；手术器械(江苏三兴医疗器械公司)；显微镜及数码成像系统(Olympus BX50、DP50)。
实验方法：
载骨形态发生蛋白多肽羟基磷灰石/聚乳酸材料的制备：将2种多肽溶液均用双蒸水溶解，将消毒后的羟基磷灰石/聚乳酸材料分别浸泡在两种多肽溶液中18 h，待其完全进入材料后取出密封，置于 4 ℃保存。2种多肽均分为0.2，0.4，0.8 g/L 3种。
实验动物分组及手术方法：将42只SD大鼠随机均分为7组，以3%戊巴比妥钠静脉麻醉生效后，无菌操作下充分暴露两侧臀部肌肉，用手术刀切开臀部肌肉浅层，分别将载0.2，0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ的羟基磷灰石/聚乳酸材料(分别记为0.2，0.4，0.8 g/L多肽Ⅰ组)、载0.2，0.4，0.8 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅱ的羟基磷灰石/聚乳酸材料(分别记为0.2，0.4，0.8 g/L多肽Ⅱ组)及羟基磷灰石/聚乳酸材料(设为对照组)放入7组动物臀部肌肉浅层，并用不可吸收丝线缝合伤口。术后动物自由活动，分笼饲养。
主要观察指标：①术后SD大鼠活动、进食、伤口愈合情况。②植入后3，5周时，各组随机选取3只鼠麻醉后摄背部正位X射线片、CT照射，然后在麻醉状态下注入空气处死，进行标本取材。③将取材标本用体积分数10%甲醛液固定24 h，将标本经硝酸脱钙12 h等处理后常规石蜡包埋，经切片(5 μm)、苏木精-伊红染色后在光学显微镜下观察组织形态。Masson染色组织学观察新生骨胶原形成(蓝色)并计算新生骨面积[5]：由于 Masson 染色对新生骨基质、植入材料及周围正常组织显色层次感明显。故可应用Masson染色对材料组织进行数据分析，采用在每组/时间点6个材料组织上，应用电子显微镜在每个标本材料区域内随机提取3个视野(×400)计算成骨(胶原)面积，未见胶原组织为0分，< 25%为1分，25%-50%为2分，51%-75%为3分，76%-100%为4分，统计并得出结果。
统计学分析：应用SPSS 19.0统计学软件，所有数据以x±s表示，多组数据之间比较采用等级资料的秩和检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨移植材料用于缺损修复最重要的是具有良好的骨传导与骨诱导作用，植入后能产生新骨，最终形成骨性愈合。近年来，材料科学、组织工程学和纳米技术的快速发展，使各种复合材料人工骨、组织工程构建人工骨、纳米人工骨相继研制成功。一些人工骨产品不仅具有良好的组织相容性，而且在一定程度上能诱导正常骨的形成，最终达到骨的修复。
骨形态发生蛋白属于转化生长因子β超家族，是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白，能够在体内诱导骨和软骨形成，并在肢体生长、软骨内骨化、骨折早期、软骨修复时表达，对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用^[9]，是目前骨移植材料中效果较理想的材料。骨形态发生蛋白是具有特殊生物学活性的细胞因子，有强大的诱导成骨能力，是骨组织形成过程中最关键的调节因子，能促进骨形成并表达分泌特异性成骨细胞产物，如Ⅰ型胶原、骨桥蛋白和骨钙素等^[10-11]。但是对于大面积骨缺损的修复，现有人工骨材料的诱导成骨能力还存在着一定的不足，因此临床往往需要将这类植骨材料与脱矿骨基质或骨形态发生蛋白等活性因子复合使用，以提高其修复骨缺损和植骨融合的效果。
美国FDA已批准进入临床的骨形态发生蛋白类产品有InFUSE Bone Graft (人重组骨形态发生蛋白2与牛Ⅰ型胶原复合)、OP.1 Putty (人重组骨形态发生蛋白7与牛胶原复合)，临床应用结果表明其具有很好的促进成骨作用。宁江海等^[12]尝试合成了具有羟基磷灰石结合活性的纤维连接蛋白和转化生长因子β模拟多肽，对羟基磷灰石进行改性研究；段智霞等^[13]设计合成的人重组骨形态发生蛋白2 活性多肽，能有效促进间充质干细胞向成骨方向分化。刘虹丽等^[14]观察了成骨生长肽(OGP)羧基端片段[OGP(10-14)]及其衍生物ⅠC8I对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响，体外实验结果表明其可以有效刺激体外培养成骨细胞的增殖，促进细胞分化。Tang等[15]也设计了骨形态发生蛋白2活性多肽P24，经试验证明其能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，具有较好的异位和原位成骨能力。但总的看来，这方面还处于摸索阶段。
虽然天然人骨形态发生蛋白2成熟肽由114个氨基酸组成，但真正发挥骨诱导作用的核心功能区段仅由5-20余个氨基酸组成，作者根据骨形态发生蛋白2氨基酸序列中诱导成骨的核心功能区段(20个氨基酸)，通过FMOC/tBu固相多肽合成法合成含20多个氨基酸的寡肽-骨形态发生蛋白2活性多肽，并根据氨基酸序列排列不同分为2个实验组，希望保留骨形态发生蛋白2的强骨诱导能力，并克服现阶段骨形态发生蛋白2制备的许多问题。骨形态发生蛋白2活性多肽中包含磷酸化的丝氨酸及天冬氨酸，能极好模拟天然骨基质的促发及指导矿化功能，在局部形成偏酸环境，促进局部钙磷沉积、成核和生物自组装矿化^[16]。
以往相关研究证实了骨形态发生蛋白2活性多肽具有体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用[17]。骨形态发生蛋白2有优秀的骨诱导能力，但缺乏力学强度且难于塑形，单独使用效果不佳，常需要合适的载体；而羟基磷灰石/聚乳酸易于塑形且具有适当的力学性能，可补充这点不足。羟基磷灰石是天然骨骼中最主要的无机成分，较其他生物材料具有更好的生物相容性、安全性及骨传导性，尽管羟基磷灰石具有以上优点，但其主要缺点是力学性能差、强度低^[18]。聚乳酸是目前组织工程研究中较常用的聚酯类生物降解材料支之一，有良好的生物相容性和机械强度^[19]。Todo等^[20]将羟基磷灰石与聚乳酸复合以用来加强聚乳酸的刚性和生物活性，而杜欧等[21]证明了羟基磷灰石/聚乳酸复合材料的机械性能大于单独这两种材料的每一种，并且无毒性，羟基磷灰石/聚乳酸复合材料被逐渐证实为优良的人体骨组织的替代材料[22]。将具有优秀骨诱导能力的骨形态发生蛋白2多肽与骨组织工程常用的框架材料相结合，希望能达到互补的作用，从而成为理想的植骨材料。
鼠异位植入模型是用来评价骨诱导能力的传统方法^[23]，实验通过X射线、CT检测钙化面积，而对照组在图像上并未成明显的高密度，减少了不必要的麻烦。钙化是成骨细胞最终分化的指标，但由于在制作普通石蜡切片前需要脱钙，故实验选用苏木精-伊红、Masson染色进行组织学观察。Masson染色可以显著区分胶原和其余组织，骨组织中主要成分是胶原、基质黏多糖、钙化物，骨中的胶原是Ⅰ型胶原，在成熟骨的Masson三色染色中胶原着红色；软骨胶原是Ⅱ型胶原，对Masson三色染色呈蓝色，新生骨在成熟过程中着蓝色至红-蓝相间色[5-6]。本实验证明随质量浓度升高，骨形态发生蛋白多肽能有效促进材料的骨诱导能力，载0.4 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅰ羟基磷灰石/聚乳酸材料的骨诱导能力强于载0.4 g/L骨形态发生蛋白多肽Ⅱ羟基磷灰石/聚乳酸材料。综上所述，各实验组的骨诱导能力均高于对照组，均有明显骨样组织形成，证明骨形态发生蛋白多肽Ⅰ与骨形态发生蛋白多肽Ⅱ均有骨诱导能力，且骨形态发生蛋白多肽Ⅰ高于骨形态发生蛋白多肽Ⅱ。
骨形态发生蛋白人工合成多肽的加入使得人工骨修复材料的成骨效应有所增强，提高了其在体内的稳定性和骨诱导活性，可能解决现有国内外制作基因重组骨形态发生蛋白的几个问题^[24]，使制作工艺简单化，生产周期减短，产量增加，成本降低，有望成为骨修复治疗中替代自体骨的一种良好骨移植材料，但其效果距离InFUSE Bone Graft、OP.1 Putty 仍有不小距离，有文献证明这些材料在三四周局部有新生骨形成[25-26]，而本实验证明人工多肽在5周时还处于成骨中期阶段，仍以骨胶原为主，故仍需要进一步改良材料，并且骨诱导实验只是材料动物实验的一部分，仍需进行动物体内骨缺损材料植入实验进一步证实其成骨能力、生物力学情况等。