干细胞治疗1型糖尿病：问题与前景

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.024

摘要/Abstract

摘要：

背景：1型糖尿病是以胰岛β细胞被破坏为特点的自身免疫性疾病，患者需要依靠外源性胰岛素才能生存，目前仍缺乏特效的治疗方式。
目的：综述各类干细胞的来源、分化能力、自身排斥以及存在的问题，从而为1型糖尿病的再生治疗提供依据。
方法：以“type 1 diabetes mellitus，stem cell，stem cell therapy，regeneration treatment，stem-cell differentiation，stem-cell transplantation， immune suppression，insulin secreting cells，islet β-cells，therapeutic effect”为英文检索词，由第一作者检索2003至2015年PubMed数据库，查阅干细胞治疗1型糖尿病的相关文献，最终保留了42篇文献进行分析。
结果与结论：干细胞治疗1型糖尿病引起了相当多的关注，目前理想的治疗方式就是通过外源性干细胞移植使β细胞再生，即通过干细胞在体外适当的培养条件下诱导分化为具有内分泌功能的胰岛β细胞。通过各类研究，既阐述了干细胞的来源、定向分化、纯化、免疫抑制等特点以及存在的问题，还针对1型糖尿病的发生发展进行讨论，以选出最佳的干细胞来源，从而有助于治疗该疾病。

关键词: 干细胞, 移植, 干细胞移植, 1型糖尿病, 干细胞分化, 免疫抑制, 胰岛β细胞, 胰岛素分泌细胞

Abstract:

BACKGROUND: Type 1 diabetes mellitus is an autoimmune attack characterized by the selective destruction of pancreatic cells. Patients need to rely on external insulin to survive, and there is a lack of specific treatment.
OBJECTIVE: To review the source of all kinds of stem cells, differentiation capacity, self-exclusion and existing problems, and to provide the basis for regeneration treatment of type 1 diabetes mellitus.
METHODS: In order to search relevant article about stem cell therapies for type 1 diabetes mellitus from PubMed database (from 2003 to 2015), a computer-based search was performed using the key words of “type 1 diabetes mellitus, stem cell, stem cell therapy, regeneration treatment, stem-cell differentiation, stem-cell transplantation, immune suppression, insulin secreting cells, islet β-cells, therapeutic effect” in English. Finally, 42 articles were chosen for further analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus has attracted quite a lot of attentions. Restoration of damaged β-cells by exogenous stem cell transplantation is the currently ideal therapeutic options, that is, stem cells cultured under suitable conditions can be induced into islet β-cells that have endocrine function. Through all kinds of research, this paper expounds the source of stem cells, directional differentiation, purification, immune suppression characteristics and existing problems, and it also has a discussion for the occurrence and development of type 1 diabetes mellitus so as to select the best scheme of stem cells, which helps to cure the disease.

Key words: Diabetes Mellitus, Type 1, Insulin-Secreting Cells, Stem Cell Transplantation

中图分类号:

R318

白宇. 干细胞治疗1型糖尿病：问题与前景[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 3096-3101.

Bai Yu. Stem cell therapy for type 1 diabetes mellitus [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 3096-3101.

图/表（结果） 1

2.1 1型糖尿病概述 1型糖尿病是以β细胞永久性破坏为特征，具体的发病机制尚不明确，目前认为自身免疫异常是其最主要的致病因素，当此类人群与特定环境或食物接触后，致使T细胞功能改变，分泌大量γ-干扰素、白细胞介素2等细胞因子触发自体胰岛炎症反应，致使胰岛细胞破坏和功能损害，胰岛素分泌缺乏引发1型糖尿病，最终只能依靠外源性的胰岛素来控制血糖水平^[2]。综上所述，1型糖尿病发病原因可以概括为三大因素，分别为环境因素、免疫因素、遗传因素。
2.1.1 环境因素病毒一直被认为是1型糖尿病发病的一个主要诱因，许多人认为谷氨酸脱羧酶和病毒的交叉反应蛋白决定簇有一定的相似度。肠道病毒是诱发自身免疫系统反应的最主要元素，最终导致活化的T细胞转而攻击胰岛细胞。在一项动物模型实验中，病毒感染引起严重的胰腺炎症反应，MHC-Ⅰ类分子表达上调，使得胰岛β细胞CD8+表达上调，这就是杀伤β细胞的关键^[3]。当然，病毒感染只是一个诱发因素，并不会导致所有个体发生胰腺自溶的情况，个体间存在差异的原因不明。药物成分和化学物质也是罪魁祸首之一，其中最熟悉的就是四氧嘧啶，通过破坏胰岛细胞，使胰岛素分泌减少甚至停止。这种物质现如今常用来制作糖尿病的动物模型。值得一提的是日常饮食也是1型糖尿病的发病因素之一，如生活上最常见的牛乳，牛乳中的白蛋白与胰岛细胞抗体发生交叉反应，导致病发^[4]。
2.1.2 免疫因素免疫因素是1型糖尿病发病的另一原因。β细胞表面的Fas(CD95)受体可能是1型糖尿病致病的罪魁祸首，因为该受体是一个诱导凋亡的分子，通过与CD4+和CD8+T细胞的结合诱导β细胞发生凋亡。CD8+T细胞被认为与1型糖尿病发病有着紧密联系，在1型糖尿病的患者中发现胰岛细胞周围有大量CD8+T细胞浸润，但是缺乏MHC-Ⅰ类分子的动物模型却没有发展为糖尿病，这也说明CD8+T细胞与MHC-Ⅰ类分子相互作用，才能引起1型糖尿病^[5]。
CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)是通过调节细胞因子和细胞间的相互作用调节T细胞。在对糖尿病的动物模型鼠和1型糖尿病患者的研究中发现，调节性T细胞不仅数目减少，而且使T细胞的调节能力也减弱，这间接说明着1型糖尿病的发病与调节性T细胞所引起的免疫T细胞的失衡有着一定联系[6]。自然杀伤T细胞通过迅速产生大量细胞因子来调节免疫反应。当自然杀伤T细胞缺乏时，可以使体内Th2细胞功能不足，从而发生自身免疫疾病[7]。树突状细胞呈递抗原至T细胞是免疫反应的关键。胰岛炎症时树突状细胞的含量是非常丰富的，因此容易受到免疫细胞的聚集攻击。B淋巴细胞通过将特定的β细胞自身抗原呈递至T细胞，由此形成内在缺陷，这也是1型糖尿病的致病作用。此外B淋巴细胞分泌的抗体如胰岛素瘤相关蛋白2(IA-2)、ZnT8抗体，与β细胞抗原结合，可以触发有着细胞毒性的自身反应T细胞。B淋巴细胞分泌的炎症因子，如肿瘤坏死因子、白细胞介素等，也能加剧免疫反应。另外还有人认为巨噬细胞的死亡与1型糖尿病的进展有着密切关系^[8]，见图1^[9]。
2.1.3 遗传因素胰岛素基因的串联重复序列(VNTR)的数量与1型糖尿病的发病风险相关，据报道Ⅰ型串联重复序列纯合子的风险最高^[10]。人类白细胞抗原基因(HLA)上的第六号染色体短臂是1型糖尿病的易感基因位点，此类患者的数量比较少。细胞毒性T细胞相关蛋白4基因(CTLA-4)是免疫调节的负调节分子，该基因的变异可能会通过mRNA水平来影响自身免疫系统^[11]。这些致病的基因决定着个体患1型糖尿病风险的高低，但是对于深层次的起着决定性的相关遗传表达仍需要进一步探索。
2.2 干细胞治疗尽管通过胰腺或胰岛移植技术为部分患者重新建立内源性分泌系统^[12]，但是仍然面临供体来源不足的情况。而干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，具有在一定条件下分化为各种细胞、组织、器官的功能，并且细胞来源丰富、免疫原性低。因此，可以通过体内外诱导干细胞定向分化成为具有分泌胰岛素能力的细胞，以恢复胰岛功能，从而达到治愈1型糖尿病的效果。目前干细胞治疗 1 型糖尿病的研究可分为胚胎干细胞、成体干细胞和诱导多能干细胞^[13]。
2.2.1 胚胎干细胞胚胎干细胞来源于囊胚内细胞团，是一种全能干细胞，并具有长期未分化增殖的潜能，在适当的培养环境下，可以定向诱导分化成为产胰岛素细胞，这为1 型糖尿病的治疗提供了新的思路^[14]。Rezania等应用稳定的人胚胎干细胞系 H1，先在体外将其诱导为高表达胰十二指肠同源盒因子PDX-1 (pancreatic duodenal homeobox-1，胰腺发育和 β细胞成熟所必需的转录因子)的胰腺祖细胞群，再将该细胞群移植至链脲霉素诱导的糖尿病小鼠体内。随着祖细胞向胰腺内分泌细胞分化，该组织所产生的胰岛素水平逐渐增加，当达到一定程度时，糖尿病小鼠可以脱离外源性胰岛素。为了探究高表达PDX-1的胰腺祖细胞群的内分泌能力以及相关限制条件，Kahan等^[15]证实鼠胚胎干细胞只有在其他胰岛细胞存在的情况下，才可以使胚胎干细胞保持最佳的分化状态，并强调微环境对于干细胞分化的影响，而Brolen等^[16]将人胚胎干细胞诱导至胰腺祖细胞阶段，尽管这些诱导细胞表达 PDX-1而被证实为胰腺祖细胞，但是并不能分泌胰岛素，也没有糖反应性，而将PDX-1阳性的胰腺祖细胞移植入体内后却可以继续分化成熟，具有合成和加工胰岛素的能力。二者研究结果极为相似，说明了人胚胎干细胞可以对体内微环境应答并形成胰岛内分泌细胞。此外有人还通过蛋白转导技术，利用细胞膜，把PDX-1转录因子嫁接到胚胎干细胞的细胞核内，然后予以适当的环境，进而获得了高表达水平胰岛素的细胞^[17]。尽管该研究证明了胚胎干细胞可以作为治疗1型糖尿病的一个新方向，但是由于缺乏干细胞衍生物的稳定性和不良反应的研究，以及外界致畸作用的可能及伦理道德争议，使得人胚胎干细胞的临床应用阻力较大。
2.2.2 成体干细胞
胰腺干细胞：在胚胎发育过程中，胰腺干细胞是没有进行终末分化的胰腺细胞，它具有分化成为各种胰腺细胞和自我更新的能力。因此，体外分离胰腺干细胞并在适当的环境下培养，诱导其分化成为具有内分泌功能的胰腺细胞，是细胞替代治疗的重要来源。然而，在成熟胰腺组织中β细胞的祖细胞的存在还有争议，大多数学者认为表面成熟胰腺组织中没有β细胞的新生^[18-19]，只有自我复制的能力。但是也有另外一些学者认为胰腺干细胞参与β细胞的更新^[20-21]。由于胰腺干细胞在成熟胰腺组织中的具体功能和定位还未知，并存在分离和转分化等技术上的问题，因此，胰腺干细胞替代治疗仍然需要进一步深入研究。
间充质干细胞：间充质干细胞最初在骨髓中发现，在骨骼肌、脂肪组织、脐血中证实了间充质干细胞的存在，并定位为一类具有自我更新、多向分化潜能、来源于中胚层的非造血组织干细胞。由于间充质干细胞的来源丰富且致瘤致畸风险较低，因此间充质干细胞成为1型糖尿病替代治疗的主力。在一定的环境下培养，可诱导间充质干细胞分化成有分泌功能的胰岛组织，并能发挥其免疫调控功能。换言之，间充质干细胞在一定程度上有着抵抗胰岛β细胞被免疫T细胞攻击的能力^[22]。例如，体外研究显示间充质干细胞可以影响免疫细胞的抗原提呈并抑制其增殖、促进受损组织再生等^[23]。此外，在糖尿病发病初期，应用自身骨髓间充质干细胞治疗后，抑制胰腺自身免疫反应应答，进而避免了胰岛的损伤加重^[24]。在大鼠糖尿病模型中发现，人骨髓间充质干细胞能被诱导表达足量胰岛素控制血糖并能保护人胰岛免受炎性细胞因子的侵害^[25]。在美国，有23名儿童应用自体脐血间充质干细胞治疗1型糖尿病，大多数接受治疗的儿童血糖控制改善，并能产生内源性胰岛素^[26]。Trivedi等^[27]利用脂肪组织来源的间充质干细胞转化成的生成胰岛素细胞联合造血干细胞治疗病程0.6-10年的5名1型糖尿病患者，随访2.9个月后，患者的胰岛素需要量降低30%-50%，血清C肽水平4-26倍升高。对于糖尿病患者，利用间充质干细胞诱导分化成为胰岛素细胞，一方面解决了移植供体匮乏的情况，另一方面有效地抑制了免疫反应进而保护胰岛再损伤。但是在现阶段，利用自身骨髓间充质干细胞诱导分化为胰岛β细胞的数量和功能都不容乐观^[28]，仍需要进一步深入研究。
造血干细胞：由于造血干细胞比较容易获取，并且没有伦理争议和免疫排斥反应，因此，造血干细胞也成为了1型糖尿病干细胞移植的热门焦点。目前，已经存在几个将造血干细胞诱导分化为胰岛细胞的案例，这也更支持通过造血干细胞来治疗1型糖尿病的观点。Ianus等^[29]通过荧光蛋白技术标记的造血干细胞移植到小鼠模型中，观察造血干细胞的分化情况，在2个月后发现了骨髓来源的胰腺细胞。当在生理性葡萄糖刺激下，骨髓来源的胰腺细胞不仅分泌胰岛素，并且使胰腺β细胞的钙离子发生内流。Voltarell等^[30]对15例新诊断的1型糖尿病患者使用过高剂量的免疫抑制剂环磷酰胺后，植入自体非髓性造血干细胞，随访7-36个月后发现，14例患者的胰岛β细胞的分泌功能得到增加，大多数患者对于胰岛素的依赖性减少，大约在6个月后，15例患者的C肽水平均增加，并且在15例患者中有13例患者的糖化血红蛋白水平低于7%，这也说明了在免疫抑制剂的作用下，胰岛β细胞所遭受的免疫T细胞攻击减弱，从而利于造血干细胞分化为胰岛素细胞，因此可以认为造血干细胞在体内的转分化是需要低免疫应答的。中国南京鼓楼医院也开展了一项类似于VOLTARELL研究，对13例新发1型糖尿病患者进行自体造血干细胞移植并随访31-54个月，结果表明11例患者的胰岛素使用时间和剂量均减少，免疫相关指标有所改善，特别是伴有糖化血红蛋白水平的下降和C肽的上升，另外有3例患者在7-54个月中无需胰岛素的依赖^[31]。因此，对于1型糖尿病的治疗，造血干细胞是一个不错的选择。
精原干细胞：多项研究显示精原干细胞可诱导分化为具有3个胚层的类胚胎干细胞。有学者将精原干细胞从睾丸中提取后进行培养，不需要基因转染等手段便可将其诱导为多能干细胞^[32]。Morimoto等[33]研究人睾丸组织的干细胞相关标记和分化情况，发现精原干细胞与胚胎干细胞有着显著差异，却和间充质干细胞极为相似。可见精原干细胞在一定程度上与间充质干细胞的再生治疗等同，应当深入探索精原干细胞诱导方法和机制，同时也可对来源于卵巢的干细胞进行类似的研究。
肝脏干细胞：肝细胞和胰腺β细胞均具有感应血糖浓度的能力并发挥降糖作用，这是因为肝脏和胰腺都源于内胚层。在高浓度葡萄糖的环境下或者利用遗传重组的方法，肝干细胞能被诱导分化为胰腺β细胞，因此利用肝脏干细胞的分化来治疗1型糖尿病也是一种新的方向。PDX-1是成熟胰腺的重要转入因子，胰腺所有细胞均有PDX-1的表达，对于人类而言，PDX-1相关蛋白的功能缺陷可导致胰腺发育不完全^[34]。研究表明，用慢病毒载体介导转染肝干细胞以此获得表达PDX-1的能力，结果显示，该细胞系成功地转化为能分泌胰岛素的细胞群体，检测出胰腺相关的表达基因谱，并对高葡萄糖刺激下做出分泌胰岛素的反应[35]。在1型糖尿病动物实验模型非肥胖性糖尿病(non-obese diabetic，NOD)小鼠中，同样通过携带PDX-1基因的病毒转染，获得表达PDX-1的肝干细胞，在24 h后，发现NOD小鼠的血糖水平开始下降，直至正常范围，且维持到实验终末期，相关实验还显示了表达PDX-1的肝干细胞并未刺激免疫系统，且新生的内分泌胰岛素细胞并未破坏[36]。结果显示肝干细胞是可以分化为胰岛β细胞，但是具体的机制并不清楚，仍然需要深入探索。
脐血干细胞：由于脐血干细胞具有数量大、再生潜能高、储存安全方便、移植物抗宿主反应低、人类白细胞抗原匹配不严格等优点，这使得脐血干细胞也入围了再生治疗1型糖尿病的候选名单。Ende等^[37]将脐血细胞通过静脉系统分别注入2型糖尿病小鼠和1型糖尿病小鼠体内，结果显示血糖降低的幅度与注入脐血的数量呈正相关，该方法不仅能缓解糖尿病症状，减少胰腺炎症的发生，还能延长小鼠的生存时间。而Haller等^[38]选取15例1岁以上的1型糖尿病患儿，将他们自身的脐血干细胞静脉注入体内，经过2年的观察，发现15例患儿的糖代谢和胰岛素分泌情况均良好。虽然脐血干细胞转化为内分泌胰岛素细胞的具体机制并不明确，但是从宏观的角度看，二者之间存在着紧密的联系，可进一步从分子、基因等方向研究脐血干细胞与胰岛细胞之间的关系，这将会对于1型糖尿病的治疗有很大帮助。
2.2.3 诱导多能干细胞诱导多能干细胞是在外源性因素作用下，使分化成熟的细胞转化为具有多向分化潜能的干细胞—将转录因子的基因片段转染到体细胞中，通过重新编码而获得多能干细胞。Barnur等^[39]将β细胞来源的诱导多能干细胞诱导分化为内分泌胰岛素样细胞，在高葡萄糖刺激下，能够分泌胰岛素，而在移植入1型糖尿病小鼠动物模型后，发现血糖下降至正常范围，且糖化血红蛋白水平下降了4.5%，这也为诱导多能干细胞在临床上治疗1型糖尿病提供了依据。Kuise等^[40]利用KIF4、SOX2、OCT4等转录因子作用于人成纤维细胞中，获取诱导多能干细胞，再利用这些诱导多能干细胞诱导分化为表达PDX-1的细胞，并且在高葡萄糖刺激下，分泌胰岛素并释放C肽，这也说明了诱导多能干细胞转化为胰岛β细胞是可行的。通过腺病毒产生诱导多能干细胞可以在短时间内高表达外源性基因，但是不会整合到宿主基因内，确保了诱导多能干细胞的临床安全性^[41]。由于诱导多能干细胞不存在伦理问题，通过患者自身体细胞便可获得，因此精原干细胞是被包含于诱导多能干细胞的范畴的，从而有人将精原干细胞在适当的条件下加入适当的生长因子以获取多向分化潜能的诱导多能干细胞^[42]。这种再生技术，尽管避开了一些伦理和法律上的争议，但也存在着潜在的表观遗传和遗传异常的风险，可能导致致畸致瘤。
2.3 目前存在的问题就目前而言，干细胞移植替代β细胞治疗1型糖尿病具有潜在的治疗价值，但是相对于临床应用而言，这种再生技术仍然存些一些问题。如干细胞本身存在的免疫排斥、分化定向、分化有效率以及异常分化等问题，加上操作技术的难度比较大，因此，这就导致了一些隐性的生物安全问题和医疗纠纷等。
对于小型临床试验来说，问题可以概括为以下几方面：①干细胞的输入途径不确定，当前有经静脉系统或胰腺动脉或者二者联合，但是目前对于二者的对比性研究尚未开展，故当中的差异也未知。②控制临床试验中混杂因素的方法尚未成熟，应用于干细胞治疗的纳入标准和排除标准也没有定论，如1型糖尿病和2型糖尿病患者的治疗方案、有其他并发症的同时如何联合其他治疗等。③对于干细胞剂量的选择。不同种类干细胞的定向分化能力不一样，且干细胞的分化程度受外周环境的影响比较大，因此不同剂量干细胞的应用，可能产生一些非治疗作用的衍生物，进而导致一些未可知的变故。④不同的研究对于干细胞的采集方法也是有差异的，因此，在技术层面上，应当考虑所采集的干细胞纯度以及副产物，因为这种差异可能影响临床疗效的评价。

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