2.1 富集骨髓的获取方法 目前常用的富集骨髓获取方法有2种：应用细胞富集系统或加入医用级细胞分离液进行梯度密度离心。细胞富集系统直接将骨髓中不同密度的细胞进行分离，收集有核细胞，即得到富集骨髓，此富集骨髓过程迅速，无需加入任何物质，常用系统有Marrow Stim Concentration System(Biomet)、MXP MarrowXpress System (ThermoGenesis)等[10-13]。使用细胞分离液获取富集骨髓操作如下：将新鲜抗凝骨髓血缓慢加入细胞分离液的液面上，避免骨髓血与细胞分离液混合，离心后吸取中层有核细胞层，弃掉底部红细胞，即得到富集骨髓[14-15]，见图1。这两种方法原理相同，过程均简便迅速，感染及异物反应风险较低，能够较好地保持细胞及因子的生物活性。
2.2 富集骨髓的细胞成分及其生物学作用 富集骨髓含有多种细胞成分，包括骨髓间充质干细胞、造血干细胞、内皮祖细胞及血小板等，同时含有多种生长因子及细胞因子，包括血管内皮细胞生长因子、肝细胞生长因子等
[2]。
在富集骨髓的多种细胞组分中，骨髓间充质干细胞的比例为0.01%-0.001%
[16]。研究证实骨髓间充质干细胞具有多向分化能力及多种生物学功能，包括：①促进组织再生及血管生成。骨髓间充质干细胞可分泌多种细胞因子，如转化生长因子α和转化生长因子β、肝细胞生长因子、骨细胞形成蛋白等，促进上皮细胞、内皮细胞、成骨细胞等细胞的增殖分化
[17]。同时，骨髓间充质干细胞可分泌血管内皮细胞生长因子及血管生成素1，招募血管内皮细胞，启动血管生成
[18-24]。②抗炎及免疫调节功能。在炎症反应的过程中，骨髓间充质干细胞可分泌多种免疫调节因子如前列腺素E2、基质细胞衍生因子1等
[25-27]。同时，骨髓间充质干细胞可直接抑制多种炎性细胞如T淋巴细胞，B淋巴细胞，NK细胞，单核细胞等的增殖、成熟及分化
[28-30]。③抗凋亡作用。骨髓间充质干细胞可以挽救因高氧、化学、机械、放射伤害等而濒临凋亡的细胞[31-33]。④抵抗细菌感染。骨髓间充质干细胞可分泌活性肠肽等，抵抗部分革兰阳性及阴性细菌的感染
[34-35]。
富集骨髓中另一重要的细胞组分为内皮祖细胞。内皮祖细胞循环存在于骨髓及外周血中，是血管内皮细胞的前体细胞[36]。内皮祖细胞是一种较为成熟的干细胞，平时静止存在于骨髓微环境中，在缺氧或损伤发生时可被动员入血液循环，继而到达缺血损伤部位，起到促进新生血管形成、修复受损血管、维持血管损伤修复动态平衡等作用
[37-38]。内皮祖细胞的作用表现为以下3个方面：①内皮祖细胞可直接参与血管形成及血管损伤修复过程。内皮祖细胞可聚集于缺血部位并直接整合于血管中，参与形成新的管腔，增加血管数量
[39-40]。②内皮祖细胞可分化为成熟内皮细胞，参与血管新生。研究表明，新生血管中，26%的内皮细胞来源于内皮祖细胞
[39，41]。③内皮祖细胞可分泌血管内皮细胞生长因子、基质细胞衍生因子1等细胞因子，招募成熟内皮细胞并促进其增殖，共同参与血管修复及新生血管形成
[42-44]。内皮祖细胞参与血管形成的过程出现在众多疾病的恢复过程中，如心肌缺血、肢体缺血、缺血性脑卒中等
[43]。
除骨髓间充质干细胞及血管内皮细胞外，富集骨髓中的其他细胞及因子成分亦共同参与组织再生和血管新生过程。以上研究成果为富集骨髓在再生医学领域的临床应用提供了理论基础。
2.3 富集骨髓在再生医学领域的应用进展 由于具有来源丰富，获取简便，感染及排异风险小等优点，富集骨髓已被应用于多种疾病的临床治疗中，在促进创伤愈合、组织再生、减轻疼痛等方面取得了良好的效果。
2.3.1 富集骨髓在骨缺损治疗中的应用 相较于人体的其他组织，骨组织具有较强的愈合能力。大多数情况下，骨组织损伤能够得到较好的愈合，而高能量创伤、开放性骨折、骨质疏松等因素往往导致骨折延迟愈合或不愈合，造成骨缺损及骨不连。骨折断端缺损较大的情况下，难以自主愈合，需要利用自体或异体骨移植来进行修复，然而移植骨来源有限，术后易发生感染、骨囊肿、假关节形成等并发症。长骨骨干皮质较厚，骨痂形成较难，是骨折延期愈合及不愈合的好发部位。经皮自体富集骨髓移植或将富集骨髓与生物材料、自体骨或异体骨联合移植治疗骨缺损均获得了良好的效果。
Le Nail等[11]应用经皮富集骨髓移植的方法治疗43例胫骨骨折延迟愈合或不愈合患者，术后17周内有23例患者骨折愈合，证明单独将富集骨髓移植到骨折部位可促进骨折愈合。Vulcano等
[4]应用富集骨髓联合异体骨及人工关节治疗髋关节骨缺损，共5例患者接受治疗，抽取的新鲜骨髓量约60 mL，富集后得到10 mL富集骨髓，移植后1，3，6，12个月进行影像学检查，结果显示在平均3.5个月时即有4例患者出现了骨缺损的愈合及新骨的生长。Jager等[45]利用富集骨髓联合两种不同支架材料治疗39例骨缺损，分别为多孔羟基磷灰石颗粒与猪明胶蛋白海绵。移植前及移植后2周、6周、6个月、12个月，患者进行了正侧位数字X射线摄影检查，评估骨缺损的大小及新骨形成情况。移植前及移植后6个月对患者的日常生活、运动能力及行走距离也进行了评估。结果显示，39例患者中有36例患者获得了完全骨愈合，所有患者均未出现严重并发症并恢复术前的活动水平。以上研究结果证实富集骨髓移植与其他治疗方式联合使用治疗骨缺损亦取得了良好的效果。富集骨髓经皮注射的方法治疗骨折延期愈合、骨不连、骨缺损等疾病，治疗过程简便省时，可满足临床急诊及及时治疗的需要，可获得较为稳定的治疗效果，目前已在临床上广泛使用，是一种简便、有效且花费较少的治疗方法。
2.3.2 富集骨髓在股骨头坏死治疗中的应用 非创伤性股骨头坏死的发生与多种因素密切相关，如乙醇滥用、皮质激素治疗及自身免疫性疾病等，但其病理生理过程目前仍不明确。有研究认为，非创伤性股骨头坏死与股骨头内骨髓间充质干细胞数量减少、增殖能力减弱导致的成骨、骨坏死之间的不平衡有关。研究证实富集骨髓内的骨髓间充质干细胞有多向分化能力，可向成骨细胞分化，内皮祖细胞及多种细胞因子可促进血管新生，多种因素的共同作用可促进股骨头部新骨的形成。Hernigou等
[46]使用富集骨髓注射治疗342例股骨头坏死患者(共534侧髋关节)，随访时间为12年，其中371侧髋关节坏死体积减小。Gangji等
[47]报道了24例髋关节缺血性坏死的5年随访数据，在这项前瞻性、双盲的随机对照试验中，11侧只进行了常规治疗的髋关节中，8侧呈现出了疾病进展，表现为软骨下骨完整性破坏；而在使用了富集骨髓治疗的13侧髋关节中，仅有3侧出现了同样的情况。王佰亮等[48]利用富集骨髓联合髓芯减压方法治疗45例股骨头坏死患者，治疗后均有明显改善，临床优良率为79.66%。以上研究数据表明富集骨髓对于股骨头坏死具有较好的的治疗效果，应用较为广泛。富集骨髓促进股骨头部骨质再生的细胞及分子机制有待于进一步研究。
2.3.3 富集骨髓在软骨疾病治疗中的应用 软骨是一种缺乏血管和神经的终末分化组织，一旦受损，很难进行自主修复。软骨损伤是造成关节炎症及疼痛的主要原因，给患者造成了巨大的痛苦。近年来将富集骨髓与透明质酸或胶原支架混合，覆盖于病变部位，用于治疗软骨炎症及损伤，取得了良好的治疗效果
[49-50](
图2)。研究表明，富集骨髓中的骨髓间充质干细胞能够在病变部位长期生存并促进软骨增生。骨髓间充质干细胞不仅可以在病变部位分化为软骨细胞，并通过物理接触及分泌细胞因子诱导病变部位原有细胞分化为软骨细胞，调控其生物行为
[51]。Cavallo等
[52]报道的体外实验中，将骨髓间充质干细胞接种于透明质酸膜Hyaff-11上进行培养，在0，40，52 d时应用MTT法及Real-Time PCR对于其增殖及分化情况进行检测，同时应用荧光染色及扫描电镜观察其细胞外基质的变化情况，结果显示骨髓间充质干细胞表达软骨系分化相关基因SOX-9、 collagen type Ⅱ、aggrecan、COMP、lumican及 fibromodulin，并随培养时间延长表达增加，说明接种于透明质酸膜上的骨髓间充质干细胞可向软骨系细胞分化；光镜及电镜的观察结果也表明骨髓间充质干细胞可产生成软骨相关的细胞外基质分子。Gigante等[53]将富集骨髓与胶原支架联合植入膝关节，治疗膝关节股骨内侧髁关节软骨缺损。术后1年随访，临床及组织学数据显示应用这种方法可得到满意的修复组织，修复组织在关节镜下显示与正常软骨相近的外观，5个病例中有3例显示修复组织为纤维软骨，1例显示为透明软骨，1例显示为透明软骨与纤维软骨的混合物。研究者认为，在此修复过程中，胶原支架上的富集骨髓细胞可能分化为软骨细胞并且在病变部位产生了纤维软骨或透明软骨细胞的细胞外基质。Enea等[54]联合应用富集骨髓与关节镜下微骨折术治疗膝关节局灶性病变。首先应用关节镜将病变处滑膜清除，然后应用微骨折锥在病变处骨面凿出孔隙，将胶原膜剪裁成与软骨缺损处相同的形状，并安放于孔隙内，将2.0-3.0 mL胶原蛋白胶与富集骨髓的混合物覆盖在胶原膜上，去除多余的混合物，屈伸膝关节确定植入物固定，随访时间为29个月，组织学及临床评估数据显示，富集骨髓与关节镜下微骨折术是一种安全、有效的治疗方法，关节软骨病变得到了有效改善，MRI扫描显示软骨缺陷得到了完整的填充。以上研究数据表明富集骨髓联合胶原或透明质酸支架移植是治疗软骨缺损及软骨病变的一种快速、简便、有效的治疗方法。
2.3.4 富集骨髓在肢体缺血治疗中的应用 肢体缺血多由血管疾病及损伤导致，轻度肢体缺血可通过手术方法进行血管再通、改善血液灌注，保全肢体，但有25%-40%的肢体缺血患者无法成功进行血管再通治疗，导致肢体溃疡、截肢甚至死亡[55-56]。Iafrati等[57]进行了多中心、双盲的随机对照试验，共48例肢体缺血患者参与试验，34例患者进行了患肢富集骨髓注射，14例患者进行安慰性假注射。术后1，4，8，12周对患者的疼痛、行走距离、生活质量是否需要截肢进行了评估，同时进行了血流动力学及组织含氧量的测试，结果显示，进行富集骨髓注射的患者在以上方面优于对照组。Amann等[58]应用富集骨髓肌内注射治疗由周围动脉疾病引起的下肢严重缺血患者51例，治疗后6个月，患者的踝肱指数及下肢经皮氧分压增高，止痛剂用量减少，总步行距离改善，无严重并发症。因此，对于外周血管疾病及损伤导致的肢体缺血，富集骨髓注射是一种安全有效的治疗方法，能够改善肢体的血液灌注，减少截肢的发生。
2.3.5 富集骨髓在心血管疾病治疗中的应用 急性心肌梗死是目前威胁患者健康的一类严重疾病。经皮冠状动脉介入治疗与支架植入是目前重新建立冠状动脉血流的首选方法，然而在冠状动脉恢复灌流之前通常已经发生心肌坏死，从而启动左心室重塑，造成心腔扩张及收缩功能障碍。Kamihata等
[59]应用猪心脏缺血模型，将富集骨髓通过冠状动脉注射到心肌缺血部位，3周后观察到缺血区血流及毛细血管数量均显著增加，约31%的骨髓细胞整合入新生血管中，与血管生成相关的细胞因子(血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)表达增加，证明骨髓细胞是治疗性血管生成的可行来源，注射骨髓细胞可有效增加缺血区域的灌注。Orlic等[60]研究表明在心肌缺血区域造血谱系阴性的骨髓细胞可分化为心肌细胞，进一步证实此方法可显著改善缺血性心肌病的近期及远期疗效。Wollert等[61]报道了心肌梗死冠状动脉富集骨髓移植治疗的随机对照临床试验，60例患有急性ST段抬高心肌梗死并成功进行了经皮冠状动脉治疗，其中30例作为实验组接受冠状动脉富集骨髓细胞移植。6个月后，实验组患者的左心室射血分数较治疗前增加了6.7%，对照组患者则增加了0.7%，证明冠状动脉骨髓细胞移植可促进急性心肌梗死后左室功能的恢复。然而，Lunde等
[62]同样进行了冠状动脉骨髓细胞移植治疗心肌梗死的随机对照试验，100例患者参与试验，其中50例患者作为实验组进行了细胞治疗。在梗死后两三周及细胞治疗后6个月显示实验组及对照组左心室射血分数，左心室舒张末期容积及梗死面积3个指标的变化并无显著差异，作者分析此结果可能与注射移植的骨髓量有关。因此，心肌梗死后冠状动脉富集骨髓移植治疗的临床有效性还需要多中心、大规模的临床试验进一步证实及研究。
3 存在的问题与展望 Problems and prospects
富集骨髓中含有骨髓间充质细胞、内皮祖细胞等多能干细胞及其分泌的多种细胞因子，其促进组织再生、创伤修复及血管新生的生物学功能已得到众多基础及临床研究的验证。富集骨髓在骨及软骨疾病中已得到了广泛的应用，但是在治疗急性心肌梗死等心血管疾病方面，其疗效还有待于进一步研究证实。富集骨髓移植后，骨髓细胞在特定部位的分化、转归及诱导定向分化等问题还需要进一步探究和明确。此外，现有的临床研究中，富集骨髓的注射量不尽相同，富集骨髓的注射量及其与临床疗效的量效关系也需要进一步研究和明确。由于富集骨髓具有显著的促进血管新生及组织再生等功能，其在整形修复外科领域如促进脂肪移植成活，皮片、皮瓣移植成活，改善瘢痕质地，减轻瘢痕增生等方面具有较大的应用价值，相关应用还需进一步的探索研究。
