神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.018

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 3054-3060.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.018

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神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征

刘吉星，侯博儒，杨文桢，马浚宁，严贵忠，陈四化，尹立山，王刚，任海军

兰州大学第二医院神经外科，甘肃省兰州市 730030

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 任海军，教授，硕士生导师，主任医师，兰州大学第二医院神经外科，甘肃省兰州市 730030
作者简介:刘吉星，男，1990年生，湖北省荆门市人，汉族，兰州大学在读硕士，主要从事神经干细胞治疗颅脑外伤基础方面的研究。
基金资助:
甘肃电信萃英科研基金资助项目(lzudxcy-2014-8)

Neural stem cells: in vitro culture, identification and differentiated phenotype

Liu Ji-xing, Hou Bo-ru, Yang Wen-zhen, Ma Jun-ning, Yan Gui-zhong, Chen Si-hua, Yin Li-shan,
Wang Gang, Ren Hai-jun

Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Ren Hai-jun, Professor, Master’s supervisor, Chief physician, Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
About author:Liu Ji-xing, Studying for master’s degree, Department of Neurosurgery, the Second Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730030, Gansu Province, China
Supported by:
Cui Ying Scientific Research Fund of Gansu Telecom, No. lzudxcy-2014-8

摘要/Abstract

摘要：

背景：神经干细胞促进受损中枢神经系统结构和功能再修复具有广阔的应用前景，而进行神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化表型的研究是实现这一应用的基础。
目的：观察神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性和分化表型特点。
方法：从新生小鼠海马、嗅球提取神经干细胞。选取3代后稳定的神经干细胞采用BrdU进行标记，并进行BrdU+巢蛋白+Hochest33258免疫荧光复合染色对神经干细胞进行鉴定。体外诱导促使神经干细胞贴壁分化，对分化产生的子代细胞进行BrdU、β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白、Hochest33258复合免疫荧光染色确定分化表型。
结果与结论：来源于新生鼠海马及嗅球的细胞连续传代培养后可形成稳定悬浮的类球状细胞团，且BrdU+巢蛋白免疫荧光双染阳性。神经干细胞体外诱导贴壁分化后可产生β-微管蛋白Ⅲ、胶质纤维酸性蛋白阳性的子代细胞。以上结果表明体外培养的神经干细胞具有很强的自我增殖更新的能力，在培养过程中趋向于形成稳定的神经球，经体外诱导通过不对称细胞增殖、分化产生神经元和星形胶质细胞等细胞表型。

关键词: 干细胞, 神经干细胞, 神经元, 星形胶质细胞, 神经球, 巢蛋白, β-微管蛋白Ⅲ, 胶质纤维酸性蛋白, 分化表型

Abstract:

BACKGROUND: Neural stem cells can repair the damaged central nervous system structure and function, which have broad application prospects. It can be realized by studies on in vitro culture, identification and differentiation phenotype of neural stem cells.
OBJECTIVE: To observe the biological characteristics and differentiated phenotypes of neural stem cells under induction in vitro.
METHODS: Neural stem cells were extracted from the hippocampus and olfactory bulb of newborn mice. After three generations, neural stem cells were labeled with 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) and identified by immunofluorescence staining of BrdU, nestin and Hochest33258. The differentiation of neural stem cells was induced in vitro and identified by immunofluorescent staining of BrdU, β-tubulinⅢ, glial fibrillary acidic protein and Hochest33258.
RESULTS AND CONCLUSION: After passage, neural stem cells from the hippocampus and olfactory bulb of newborn mice could be aggregated into neurospheres that were positive for nestin and BrdU. Under induced differentiation in vitro, neural stem cells gradually turned into daughter cells which positively expressed β-tubulin III or glial fibrillary acidic protein. These findings suggest that neural stem cells have strong self-renewal capacity and have the tendency to form neurospheres during culture in vitro; under in vitro induction, they can differentiate
into neurons and astrocytes through asymmetric cell proliferation and differentiation.

中图分类号:

R394.2

刘吉星，侯博儒，杨文桢，马浚宁，严贵忠，陈四化，尹立山，王刚，任海军. 神经干细胞体外培养鉴定及诱导分化的表型特征[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 3054-3060.

Liu Ji-xing, Hou Bo-ru, Yang Wen-zhen, Ma Jun-ning, Yan Gui-zhong, Chen Si-hua, Yin Li-shan, . Neural stem cells: in vitro culture, identification and differentiated phenotype[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 3054-3060.

图/表（结果） 4

2.1 神经干细胞生长过程中的形态学变化原代神经干细胞接种后置于倒置相差显微镜下观察可见细胞呈“颗粒状、芝麻样、满天星”似布满整个视野(图1A)。大量的单细胞悬浮、透亮，具有良好的透光度。当原代培养至三四天时可见大量单细胞聚集成球状体的细胞团，直径大小不一，细胞团处于悬浮状态(图1B)。培养至7 d时于高倍镜下可见细胞球边缘的部分细胞保持单细胞形态，彼此连接较为松散，透光性较好，而位于细胞球中心细胞连接致密，透光性稍差，细胞团整体立体感强，类似于桑葚，在视野内有波动感，周围单细胞类似于“卫星”环绕在神经球周(图1C)。另外还发现随着神经球体积增大或传代次数增多，神经球下沉，视野内的波动感和跳跃感逐渐减弱。
2.2 神经干细胞免疫荧光染色鉴定选择培养3代后纯化、生长状态良好的细胞，传代时向完全培养基中加入BrdU标记细胞48 h，接种于含有多聚赖氨酸包被的无菌玻片的24孔板中，送回细胞培养箱继续培养8 h，待大部分细胞贴壁后，进行抗BrdU、Nestin染色，Hochest33258复染细胞核，倒置荧光显微镜下观察发现视野中有典型的神经球样结构出现，并且发现BrdU(图2A)、Nestin(图2B)、Hochest33258(图2C)荧光染色均呈阳性，对照组均不显色。用NIH ImageJ软件对图像作进一步分析处理，将BrdU、Nestin、Hochest33258荧光染色呈阳性的图片融合、叠加，可见BrdU/Nestin(图2D)、Hochest33258/Nestin(图2E)、BrdU/Hochest/Nestin(图2F)复合多重荧光染色呈阳性，从而鉴定分离培养的细胞为神经干细胞。

2.3 分化过程中的神经球免疫荧光染色鉴定取已通过鉴定的神经干细胞系，撤去完全培养基，改用不含碱性成纤维细胞生长因子、B27的培养基，并加入体积分数为10%胎牛血清，在诱导分化的第1天进行抗BrdU(图3A)、Nestin(图3B)、Hochest33258(图3C)染色，发现染色结果均成阳性，对照组均不显色。用NIH ImageJ软件对图像作进一步分析处理，将BrdU、Nestin、Hochest33258荧光染色呈阳性的图片融合、叠加，见BrdU/Nestin(图3D)、Hochest33258/Nestin(图3E)、BrdU/Hochest/ Nestin(图3F)复合多重荧光染色呈阳性。分化过程中的神经球保留了未分化神经球的外观特征，可见许多触角样分支从神经球内发出，分支之间联系紧密，类似于“蜘蛛网样结构”。

2.4 神经干细胞分化为神经元样细胞的免疫荧光染色鉴定在诱导分化的第4天进行抗BrdU(图4A)、β-TubulinⅢ(图4B)、Hochest33258(图4C)染色，发现染色结果均成阳性，对照组均不显色。用NIH ImageJ软件对图像作进一步分析处理，将BrdU、β-TubulinⅢ、Hochest33258荧光染色呈阳性的图片融合、叠加，见BrdU/ β-TubulinⅢ(图4D)、Hochest33258/β-TubulinⅢ(图4E)、BrdU/Hochest/ β-TubulinⅢ(图4F)复合多重荧光染色呈阳性。细胞胞体呈梭形或椭圆形，细胞胞体缩小向核靠拢，突起呈双极或多极状，细长的突起交织成网，在空间中形成立体神经环式联系。

2.5 神经干细胞分化为星形胶质细胞的免疫荧光染色鉴定在诱导分化的第4天进行抗BrdU(图5A1，A2，A3)、GFAP(图5B1，B2，B3)染色，发现染色结果均成阳性，而对照组均不显色。用NIH ImageJ软件对图像作进一步分析处理，将BrdU、GFAP荧光染色呈阳性的图片融合、叠加，见BrdU/GFAP(图5C1，C2，C3)复合多重荧光染色呈阳性。GFAP阳性细胞胞体呈多角形，突起较多，突起未见形成明显的网状结构。单个典型的星形胶质细胞类似于“水母”，BrdU染细胞核后，显示胞核大而圆，且细胞核嵌于胞体的中央(图5C3)。

参考文献

[1] Gage FH. Mammalian neural stem cells.Science. 2000; 287 (5457):1433-1438.

[2] Gritti A, Bonfanti L, Doetsch F, et al. Multipotent neural stem cells reside into the rostral extension and olfactory bulb of adult rodents. J Neurosci. 2002;22(2):437-445.

[3] Walker MR, Patel KK, Stappenbeck TS. The stem cell niche. J Pathol. 2009;217(2):169-180.

[4] Ahmed S. The culture of neural stem cells. J Cell Biochem. 2009;106(1):1-6.

[5] Crane JF, Trainor PA. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 2006;22:267-286.

[6] Miltiadous P, Kouroupi G, Stamatakis A,et al. Subventricular zone-derived neural stem cell grafts protect against hippocampal degeneration and restore cognitive function in the mouse following intrahippocampal kainic acid administration. Stem Cells Transl Med. 2013;2(3):185-198.

[7] Lee ST, Chu K, Jung KH, et al. Anti-inflammatory mechanism of intravascular neural stem cell transplantation in haemorrhagic stroke. Brain. 2008;131(Pt 3):616-629.

[8] Sakata H, Narasimhan P, Niizuma K, et al. Interleukin 6-preconditioned neural stem cells reduce ischaemic injury in stroke mice. Brain. 2012;135(Pt 11):3298-3310.

[9] Mine Y, Tatarishvili J, Oki K, et al. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol Dis. 2013;52:191-203.

[10] Shetty AK. Hippocampal injury-induced cognitive and mood dysfunction, altered neurogenesis, and epilepsy: can early neural stem cell grafting intervention provide protection. Epilepsy Behav. 2014;38:117-124.

[11] Wang E, Gao J, Yang Q, et al. Molecular mechanisms underlying effects of neural stem cells against traumatic axonal injury. J Neurotrauma. 2012;29(2):295-312.

[12] Karussis D, Petrou P, Kassis I. Clinical experience with stem cells and other cell therapies in neurological diseases. J Neurol Sci. 2013;324(1-2):1-9.

[13] Reynolds BA, Weiss S. Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell. Dev Biol. 1996;175(1):1-13.

[14] Su P, Zhang J, Zhao F, et al. The interaction between microglia and neural stem/precursor cells. Brain Res Bull. 2014;109:32-38.

[15] Ihrie RA, Alvarez-Buylla A. Lake-front property: a unique germinal niche by the lateral ventricles of the adult brain. Neuron. 2011;70(4):674-686.

[16] Drago D, Cossetti C, Iraci N, et al. The stem cell secretome and its role in brain repair. Biochimie. 2013;95(12):2271-2285.

[17] Baraniak PR, McDevitt TC. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 2010;5(1):121-143.

[18] Qian X, Davis AA, Goderie SK, et al. FGF2 concentration regulates the generation of neurons and glia from multipotent cortical stem cells. Neuron. 1997;18(1):81-93.

[19] Ballarin C, Peruffo A. Primary cultures of astrocytes from fetal bovine brain. Methods Mol Biol. 2012;814:117-126.

[20] Jensen MB, Yan H, Krishnaney-Davison R, et al. Survival and differentiation of transplanted neural stem cells derived from human induced pluripotent stem cells in a rat stroke model. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2013;22(4):304-308.

[21] Dulin JN, Lu P.Bridging the injured spinal cord with neural stem cells. Neura Regen Res. 2014;9 (3): 229-231.

[22] Butti E, Cusimano M, Bacigaluppi M, et al. Neurogenic and non-neurogenic functions of endogenous neural stem cells. Front Neurosci. 2014;8:92.

[23] Song S,Park JT,Na JY,et al.Early expressions of hypoxia-inducible factor 1alpha and vascular endothelial growth factor increase the neuronal plasticity of activated endogenous neural stem cells after focal cerebral ischemia. Neura Regen Res. 2014;9(9): 912-918.

引言

材料方法

设计：干细胞体外培养实验。
时间及地点：2014年9月至2015年1月在兰州大学生命科学学院“脑损伤与修复实验室”完成。
材料：
实验动物：出生一两天的昆明小鼠，体质量约1.5 g，性别不限，由甘肃中医学院医学动物实验中心提供，实验过程中善待实验动物，严格执行动物伦理学的规定。

神经干细胞的体外培养鉴定及诱导分化实验所需主要试剂及设备：
试剂及设备	来源
DMEM/F12培养基、B27(without VitA)	Gibco公司
浓缩型山羊血清、胎牛血清	四季青生物试剂公司
表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)	Pepro Tech公司
Tryple express(with EDTA)	Invitrogen公司
兔抗小鼠β-微管蛋白(Tubulin)Ⅲ单克隆抗体、兔抗小鼠巢蛋白(nestin)单克隆抗体	Sigma-Aldrich公司
兔抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体	Boster公司
小鼠抗BrdU单克隆抗体、Hochest 33258原液	Abcam公司
TRITC标记的山羊抗兔IgG、FITC标记的山羊抗小鼠IgG	Earthox公司
倒置相差显微镜、荧光倒置显微镜	OLYMPUS公司
离心沉淀机	上海医用分析仪器厂
CO₂细胞培养箱	Airtech公司
超净工作台	苏州净化设备厂

实验方法：
原代神经干细胞的提取及体外培养：利用医用乙醇对出生一两天的昆明小鼠皮肤进行彻底地消毒，在无菌条件下于超净工作台内断头取脑，在底部冰敷的培养皿内分离出双侧海马、嗅球，将分离出的组织置于盛有4 ℃预冷的DMEM/F12培养基的培养皿内，显微镜下操作除去其中可能含有的血管和脑膜，并用无菌PBS冲洗，将分离的组织剪碎，转移至15 mL离心管中，加入0.25%胰酶溶液约2 mL，然后将离心管置于37 ℃水浴锅中，约10 min后取出可见组织块大部分已酶解成棉絮样胶冻状，1 000 r/min离心5 min，弃掉上清液，加入DMEM/F12基础培养基5 mL吹打混匀成细胞悬液，400目滤网过滤，再次1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入37 ℃复温的DMEM/F12完全培养基2 mL吹打混匀(配方：DMEM/F12基础培养基50 mL+1 μg碱性成纤维细胞生长因子+1 μg表皮生长因子+1 μg B27)，调整细胞密度，以5×108 L-1的细胞浓度接种于5 cm×5 cm的培养瓶中，送入培养箱中常规培养，待第3天或第4天时细胞换液。定期在倒置相差显微镜下观察细胞的生长增殖情况。
神经干细胞传代培养：神经干细胞原代培养三四天后可以观察到悬浮的神经球，此时进行半换液，约1周时神经干细胞球直径将达到100-150 μm，此时将细胞液收集于15 mL的离心管中，1 000 r/min离心3 min，弃上清后加入1 mL含有EDTA的Tryple express液，吹打混匀后置于37 ℃水浴锅中5-10 min中，然后1 000 r/min离心3 min，弃上清。用37 ℃的无菌PBS洗涤1次，1 000 r/min离心3 min。加入 37 ℃复温的完全培养基，吹打重悬后均匀分成2等份分别接种、培养。3 d后半换液，约1周时传代。
神经干细胞体外标记后染色鉴定：取培养3代后纯化、生长状态良好的细胞，传代时向完全培养基中加入BrdU标记细胞48 h(每5 mL DMEM/F12完全培养基中加入100 μL浓度为10 μmol/L的BrdU)，调整细胞的密度，10倍镜下每视野可见约10个细胞为宜，接种于含有多聚赖氨酸包被的无菌玻片的24孔板中，送回细胞培养箱继续培养8 h，待大部分细胞贴壁后除去培养液，用pH为7.33的无菌PBS洗涤3次，5 min/次，4 ℃预冷的40 g/L多聚甲醛室温下固定 35 min，无菌PBS洗涤3次，每次5 min，0.3%的Triton X-100室温孵育30 min，PBS洗涤3次，5 min/次。每孔加入2 mmol/L的HCl 500 μL，置于37 ℃的摇床中处理30 min，除去HCl，加入0.1 mmol/L的pH为8.5硼酸溶液，洗涤3次，10 min/次，每孔加入200 μL体积分数为5%的山羊血清封闭1 h，封闭过程置于37 ℃、90 r/min的摇床中，除去山羊血清，分别加入兔抗小鼠Nestin一抗(1∶100稀释)、小鼠抗BrdU一抗(1∶100稀释)，37 ℃温育30 min(一抗稀释液的配方：0.3 g BSA粉末+20 μL Triton X-100原液+4 mg NaN3+10 mL pH7.33的无菌PBS)，置于冰箱内4 ℃恒温摇床孵育过夜，约12 h后取出培养板，回收一抗，然后用PBS洗涤3次，每次7 min，避光加入TRITC标记的山羊抗兔IgG二抗、FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，二抗按1∶100稀释(二抗稀释液配方：0.3 g BSA粉末+4 mg NaN3+10 mL pH 7.33的无菌PBS)。加入二抗后将培养板避光放入37 ℃、 100 r/min的摇床中1 h，然后取出培养板每孔加入40 μL的Hoechst33258复染细胞核15 min，PBS洗3次，每次5 min。中性树胶封固，荧光显微镜下观察并拍照(加入二抗以后所有操作应尽量避光，以免荧光淬灭影响鉴定效果)。对照组则不加二抗。
神经干细胞体外诱导分化及其分化表型的鉴定：取已通过鉴定的神经干细胞系，待神经球直径约80 μm撤去完全培养基，改用不含碱性成纤维细胞生长因子、B27的培养基，并加入体积分数为10%胎牛血清，调整细胞浓度以5×108 L-1接种于含有多聚赖氨酸包被的无菌玻片的24孔板中，每孔接种细胞悬液2 mL，然后向每孔中加入200 μL BrdU，将培养板送回培养箱继续培养4 d，中途不进行换液，密切观察单细胞及神经球的形态学变化及分化情况。在诱导分化的第1天进行抗BrdU、Nestin、Hochest33258染色。诱导分化4 d后免疫荧光染色进行分化表型的鉴定，并设置对照组，此时一抗为兔抗小鼠β-Tubulin Ⅲ单克隆抗体、兔抗小鼠GFAP、小鼠抗BrdU，二抗不变，方法同前。
主要观察指标：①体外培养过程中神经干细胞的生长状态及形态学变化。②神经干细胞及其诱导分化后的子代细胞进行免疫荧光染色后的着色情况。
统计学分析：利用Image J软件进行免疫荧光的复合重叠，进行图像分析。

讨论

目前啮齿类动物神经干细胞的提取、培养等技术已基本成熟，而提取后的纯化、鉴定显得尤为重要。Reynolds等[13]创立的无血清悬浮神经球培养方法认为，稳定悬浮的神经球具有良好的生物学特性，是神经干细胞保持未分化的必要条件，也是进行分化、移植等实验研究的前提。实验中发现神经球经酶解成离散单细胞后，又开始聚集、相互连接呈抱团样生长，抱团的神经干细胞又不断分裂增殖构成桑葚状的神经球，吸引周边的单细胞聚集、环绕，这可能与神经干细胞分泌多种生物活性蛋白，包括生长因子、细胞因子、趋化因子、黏附分子等有关，这些蛋白通过与神经干细胞微环境信号发生多元应答，以自分泌或旁分泌的方式调节着自身生物学特性[14-17]。表皮生长因子主要是维持干细胞的长期存活生长，B27、碱性成纤维细胞生长因子则起到维持细胞悬浮、抑制神经干细胞分化的作用[18]。本实验证实协同使用表皮生长因子、B27、碱性成纤维细胞生长因子能使神经球中保持较高的神经干细胞比例，获得了神经干细胞体外培养的较佳条件。实验中还发现换液不及时神经球容易贴壁、分化，这可能与神经干细胞数量过多导致B27、碱性成纤维细胞生长因子消耗过快或者是神经球体积过大、内部细胞无法获得培养基中的营养和细胞因子、自身重力增加有关。本研究利用无血清培养基同时加入一定浓度的表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、B27对机械提取的单细胞悬液进行选择性培养，非神经干细胞难以适应培养条件逐步死亡，传至3代以后可获得大量稳定悬浮的神经球，用胰酶消化成单细胞悬液后继续培养仍可形成稳定悬浮的神经球，这为后续的诱导分化实验提供了良好的细胞来源。
Nestin是一种中间丝蛋白成分，是一种特异性标志抗原，由神经上皮干细胞表达，其表达始于神经板的形成，一旦神经干细胞分化成神经元和胶质细胞时，巢蛋白便停止表达，故最常用来鉴定神经干细胞。BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活细胞中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)与腺嘌呤配对结合，这种掺入可以稳定存在，随着DNA复制进入子细胞中。BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。本实验对用传代培养后形成的细胞球进行Nestin、BrdU、Hochest33258复合免疫荧光染色，发现传代后培养的细胞Nestin表达阳性，且细胞核内有明显的BrdU掺入。由于神经球由成百上千个神经干细胞抱团组合而成，细胞核重叠、聚集密集，所以抗BrdU染色时神经球整体浓染，易被误认为胞浆内的BrdU染色阳性，但仔细观察会发现神经球BrdU染色呈“蜂窝状”。实验结果证实了所鉴定的细胞为神经干细胞，且体外分离后传代培养的神经干细胞具有增殖能力，它在传代培养后仍然保持稳定的增殖能力。实验过程中海马区、嗅球区的神经干细胞在传代培养、形态变化方面无明显差异，两区域的神经干细胞可实现提取后的共培养，这也证实了新生一两天小鼠海马、嗅球组织含有丰富的神经干细胞来源。
β-TubulinⅢ是原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一，是神经元的结构蛋白，其作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究。GFAP属Ⅲ型中间丝蛋白家族成员，在活化的星型胶质细胞中大量特异性表达。实验取已通过鉴定的神经干细胞系用不含碱性成纤维细胞生长因子、B27的培养基培养，然后在24孔板中加入BrdU标记液，并加入体积分数为10%胎牛血清诱导分化，然后进行免疫荧光的复合染色。β-TubulinⅢ阳性说明所鉴定的细胞为神经元，GFAP阳性说明所鉴定的细胞为星形胶质细胞，分化的细胞BrdU染色阳性说明BrdU进入神经干细胞核内后并随着增殖分化传给子代细胞，证明了子代细胞的遗传物质来源于神经干细胞，通过β-TubulinⅢ/BrdU、GFAP/BrdU阳性的荧光双标法确定了神经干细胞经过体外诱导可分化为神经元、星形胶质细胞，实验中并未对其他中枢神经细胞内的细胞如少突胶质细胞进行鉴定，不排除培养的神经干细胞可以分化为少突胶质细胞等其他类型的细胞。诱导分化过程中定期观察发现不同时间窗分化的细胞大体形态各不同，神经干细胞在单细胞状态时可能易向神经元分化，而星形胶质细胞可能易从神经球分化而来、胞体藏于神经球中。据Ballarin等^[19]报道神经干细胞分化成星形胶质细胞的倾向与胎牛血清的浓度呈正相关。这些现象可能与诱导周期长短、神经球和单细胞数量多少有关，神经干细胞的分化具有时限性，其分化方向受特定微环境的影响。
神经干细胞的分化调控研究是神经科学研究领域的难题，也是应用神经干细胞治疗中枢神经系统疾病的理论基础，移植的神经干细胞迁移至受损神经区域，分化为不同表型的神经细胞替代受损的神经细胞或分泌神经营养因子、抗炎物质、抗氧化应激分子，拯救受损的受体细胞，启动受体神经干细胞内源性修复机制^[20-21]，使受损区形态结构恢复^[22-23]。本实验通过体外培养鉴定新生小鼠嗅球、海马组织的神经干细胞，重点观察了神经干细胞在体外培养条件下的生物学特性、增殖和分化表型的特点，为进一步体内实验深入研究神经干细胞移植治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。

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Neural stem cells: in vitro culture, identification and differentiated phenotype

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[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.