大鼠肝癌诱导过程中肝癌干细胞标志及炎症因子的动态变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来已有研究者从肝癌组织和细胞系中发现了CD133、乙醛脱氢酶(ALDH)、CD90、CD44、EpcAM、CD13、OV6、K19、c-kit、ABCG2等多种肝癌干细胞的标志物，其中CD家族的CD133、CD90、CD44等被认为与肝癌的复发和转移密切相关。
目的：探讨大鼠肝癌诱导过程中肝癌干细胞标志及炎症因子的动态变化及两者相关性。
方法：应用二乙基亚硝胺(DEN)溶液饲养SD大鼠24周诱导大鼠肝癌模型，并设立普通水喂养的健康对照组。
结果与结论：免疫组织化学检测显示，模型组肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关ED2表达呈现出逐渐增多的情况，与健康对照组比较，模型组ED2在诱癌第12，16，20，24周的表达均显著升(P < 0.05)。定量PCR 检测显示，肝癌诱导过程中CD90呈逐渐上升趋势(P < 0.05)，较之健康肝脏组织，肝癌组织中CD90上升更明显(P < 0.05)；CD133 呈现出一定升高趋势，但经单因素方差分析无统计学意义(P > 0.05)；在诱癌过程中其他肝癌干细胞标志物未出现明显改变(P > 0.05)。肝癌诱导过程中，肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、MCP-1及白细胞介素6均明显上升(P < 0.05)，较之健康肝脏组织，肝癌组织中转化生长因子β、MCP-1、白细胞介素6表达显著偏高(P < 0.05)，其余炎症因子在诱癌过程中则未出现明显改变(P > 0.05)。经Pearson相关性分析，MCP-1、转化生长因子β、白细胞介素6与CD90的表达之间呈显著正相关(P < 0.05)。表明Kupffer细胞所释放的部分炎症因子与肝癌干细胞标志之间存在一定的相关性，Kupffer细胞可促进肝癌的发生。

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肝癌干细胞标志, 肝癌, 炎症因子, 动物实验, 相关性

Abstract:

BACKGROUND: Many liver cancer stem cell markers have been found in liver cancer tissues and cell lines such as CD133, acetaldehyde dehydrogenase (ALDH), CD90, CD44, EpcAM, CD13, OV6, K19, c-kit and ABCG2. Of them, CD133, CD90 and CD44 have been shown to be strongly associated with the recurrence and metastasis of liver cancer.
OBJECTIVE: To explore the dynamic changes of liver cancer stem cell markers and inflammatory factors during the induction of liver cancer in rats and their correlation.
METHODS: Diethyl nitrosamine solution was given to Sprague-Dawley rats for 24 hours to induce rat models of liver cancer. Rats that were given common water were considered as the healthy control group.
RESULTS AND CONCLUSION: Immunohistochemical staining revealed that Kupffer cells-related ED2 expression showed a gradual increase in the model group. Compared with the healthy control group, ED2 expression was significantly higher at 12, 16, 20 and 24 weeks after induction in the model group (P < 0.05). Quantitative PCR demonstrated that CD90 showed a gradually increased trend during induction (P < 0.05). Compared with healthy tissue, CD90 increased significantly in the liver cancer tissue (P < 0.05). CD133 showed an increased trend, but one-way analysis of variance did not show significant differences (P > 0.05). During induction, no significant change was found in other liver cancer stem cell markers (P > 0.05). During the induction, tumor necrosis factor α, transforming growth factor β, MCP-1 and interleukin-6 expression levels were significantly increased (P < 0.05). Compared with healthy tissue, transforming growth factor β, MCP-1 and interleukin-6 expression levels were significantly higher in the liver cancer tissue (P < 0.05). Other inflammatory factors did not exhibit significant alterations during the induction (P > 0.05). Pearson correlation analysis demonstrated that MCP-1, transforming growth factor β and interleukin-6 expression levels were significantly positively correlated with CD90 expression (P < 0.05). These findings suggest that partial inflammatory factors released from Kupffer cells have a certain correlation with liver cancer stem cells. Kupffer cells can promote the occurrence of liver cancer.

Key words: Neoplastic Stem Cells, Liver Neoplasms, Tumor Markers, Biological

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 1

2.1 实验动物数量分析入组的35只大鼠在实验过程中未出现死亡或者脱落，全部进入结果分析。
2.2 肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关ED2表达变化经免疫组化染色检测，在模型组肝癌诱导过程中，ED2表达呈现出逐渐增多的情况，对各组的ED2阳性细胞分数进行计算和比较可得，肝癌诱ED2阳性细胞分数呈现出不断上升的情况(P < 0.05)。其中，诱导4周达(3.9±1.2)%，诱导8周(5.2±1.3)%。且较之对照组，在诱癌第12，16，20，24周的ED2阳性表达均出现显著升高的情况(P < 0.05)，其中12周(8.1±1.5)%，诱导16周(8.0±1.2)%，诱导20周(9.4±2.1)%，诱导24周(18.7±2.3)%。即表明，肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关ED2呈现出逐渐增多的趋势。
2.3 肝癌诱导过程中肝癌干细胞标志的表达经定量PCR检测，肝癌诱导过程中CD90呈逐渐上升趋势(P < 0.05)，较之健康肝脏组织，肝癌组织中CD90上升更明显(P < 0.05)；CD133 呈现出一定升高趋势，但经单因素方差分析其结果无明显变化(P > 0.05)；在诱癌过程中，其他肝癌干细胞标志物均未出现明显改变(P > 0.05)。
2.4 肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关炎症因子的表达变化经定量PCR检测，肝癌诱导过程中，肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、MCP-1、白细胞介素6均呈现出明显上升的情况(P < 0.05)。较之健康肝脏组织，肝癌组织中转化生长因子β、MCP-1、白细胞介素6表达显著偏高(P < 0.05)，其余炎症因子在诱癌过程中则未出现明显改变(P > 0.05)。
2.5 Kupffer相关炎症因子和肝癌干细胞标志相关性分析经Pearson相关性分析，MCP-1、转化生长因子β、白细胞介素6与CD90的表达之间呈显著正相关(r=0.644，0.929，0.929，均P < 0.05)；肿瘤坏死因子α与CD90的表达之间无明显相关性(r=0.197，P > 0.05)。

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引言

从细胞角度进行分析，不同的肿瘤均是由功能异质的细胞群体所组成^[1]。目前肿瘤干细胞已成为肿瘤研究领域的热点之一，多数学者认为与其他肿瘤一样，原发性肝癌中也存在肿瘤干细胞。目前还没有完全明确肝癌干细胞的特异性标志物，只能从正常肝干/祖细胞的表面标志物去推定，近年来已经有研究者从肝癌组织和细胞系中发现了CD133、乙醛脱氢酶(ALDH)、CD90、CD44、EpcAM、CD13、OV6、K19、c-kit、ABCG2等多种肝癌干细胞的标志物，其中CD家族的CD133、CD90、CD44等报道较多，被认为与肝癌的复发和转移密切相关。
肿瘤干细胞学说认为肿瘤干细胞在肿瘤的形成和发展中起着重要的作用，因此，若能证实肝癌干细胞在肝癌发病中起到的作用，将会对肝癌的治疗产生重大的意义。所以明确肝癌发生发展过程中肝癌干细胞标志物的表达变化非常必要，但相关的报道并不多。姜姗等^[2]在检测了化学诱导C57BL/6J小鼠肝癌过程中肝癌干细胞标志物CD44的动态变化，结果显示CD44在诱癌第4周轻度升高，从第8周开始明显增高，第20周出现强阳性表达，说明CD44对肝癌的发生发展有明显的调控作用。张珍妮等^[3]则报道了肝癌干细胞标志物CK19表达量随化学诱癌时间的延长而逐渐增加。以上研究均说明了肝癌干细胞参与了肝癌的发生发展，但确切调控机制有待深入研究。
肿瘤微环境的稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢的重要条件，对肿瘤的发生、发展、转移以及提高肿瘤患者的生活质量起着非常重要的作用^[4]。神经、免疫和内分泌等多个系统都会对肿瘤的转归产生影响，其中，在人体中存在大量的巨噬细胞，Kupffer细胞便为数量最多的巨噬细胞^[5-7]。
Kupffer细胞可以积极的参与到人体肝脏先天免疫系统之中，并发挥出吞噬和杀灭细菌等重要的作用^[8]。另外，Kupffer细胞还具有吞噬各种免疫复合物和微生物以及凋亡细胞和内毒素的效果，是人体肝脏先天免疫系统的重要组成部分^[9-11]。而且，在发挥免疫功能的同时，Kupffer细胞还可以释放出大量各种各样的炎症因子，并积极的参与到各类反应中。这些炎症因自积极的参与到肿瘤的发生以及发展过程中，并发挥出至关重要的作用^[12-13]。而且，Kupffer细胞所释放的炎症因子还可以参与到肿瘤干细胞的各项活动之中，包括细胞的自我更新以及上皮细胞间质转化等，对肿瘤的发生产生一定的促进作用^[14-15]。目前已知Kupffer细胞可以通过释放炎症因子的方式参与到肝癌的发生以及发展过程中^[16-17]，但是关于Kupffer细胞所释放的炎症因子与肝癌干细胞相关标志物在肝癌的发生、发展中呈现出的表达情况以及二者的相关性，目前临床尚缺乏全面、详细的报道。为此，本研究中，通过构建动物模型并进行随机对照实验的方式，了解大鼠肝癌诱导过程中炎症因子的动态变化及其与肝癌干细胞标志相关性。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
材料：

大鼠肝癌诱导实验用试剂与仪器设备：
试剂与仪器设备	生产厂家
二乙基亚硝胺(DEN)	上海沪震实业有限公司
ED2抗体	上海瑞齐生物科技有限公司
磷酸盐缓冲液(PBS)	南京森贝伽生物科技有限公司
免疫组织化学检测试剂盒	武汉博士德生物工程有限公司
DAB显色试剂盒	北京欣兴唐生物科技有限公司
Trizol试剂	福州迈新生物技术开发有限公司
PrimeScript RT reagent Kit反转录试剂盒	武汉科昊佳生物科技有限公司
引物合成	上海捷瑞生物工程有限公司
光学显微镜	北京瑞科中仪科技有限公司
微量分光广度计	德国诺尔路(广州)生物科技有限公司
实时定量PCR仪	陕西科思达生物科技有限公司
SYBR Green 荧光定量试剂盒	上海博华生物科技有限公司

实验动物及分组：SD大鼠35只，均由南京君科生物工程有限公司，毛色白化，体质量180-200 g，均为雄性，健康状况良好。本次研究相关内容和方法均经本院伦理部门审核并批准，实验设计方案、使用动物品种品系规格、处死动物的方法、项目进行中设计动物福利和伦理问题等均符合要求。
35只大鼠中随机选择5只作为对照组，其余30只构建肝癌模型，按诱癌时间分为6组，分别为诱导4，8，12，16，20，24周组，每组5只大鼠。
实验方法：
肝癌模型构建：所有大鼠均实施常规饲料喂养，对5只健康对照组大鼠予以普通水喂养，对30只模型大鼠予以体积分数0.01%DEN溶液饲养，剂量为0.1 mL/(g•d)，每周饲养6 d，剩余1 d予以普通水喂养，连续诱导24周，形成肝癌。
1-24周分别模拟了肝癌发生以及发展的整个过程，诱导1-12周为炎症反应期，13-16周为肝增生纤维化期，17-20周为肝硬化形成期，21-24周为肝癌形成期。其中，对诱导24周组的5只大鼠的肝脏组织再次进行分组，分为癌组和癌旁组。诱癌过程中，每隔4周处死模型组大鼠，获得肝脏组织并于-80 ℃条件下冷藏备用。
免疫组织化学检测大鼠肝脏组织中ED2阳性细胞：严格按照试剂盒说明书步骤内容进行操作，并利用DAB进行显色处理。于高倍镜下进行观察，了解Kupffer细胞相关ED2表达情况，并计算不同模型组ED2 阳性细胞分数。计算方法为：统计高倍镜视野下每100个细胞中的ED2阳性细胞表达分数，每只大鼠平均进行5个计数，计算获得均值和标准差，得出最终的ED2阳性细胞分数。
实时定量PCR检测炎症因子和肝癌干细胞标志的表达：严格按照试剂说明书相关内容进行操作。利用Trizol试剂提取对各组大鼠肝脏组织RNA，并对RNA浓度进行测定。然后利用反转录试剂盒反转录mRNA，获得cDNA后加入特定引物，利用SYBR Green 荧光定量试剂盒对Kupffer细胞释放的各种炎症因子以及肝癌干细胞指标进行实时定量PCR检测。其中，肝癌干细胞指标包括CD133和CD90以及AFPSirt1，GAPDH 作为内参；炎症因子检测指标包括：白细胞介素1α(IL-1α)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素8(IL-8)、转化生长因子β(TGF-β)、γ干扰素(IFN-γ)。引物合成序列见表1。

表1 引物合成序列
Table 1 Primer synthesis sequence

基因	上游引物	下游引物	产物大小(bp)
CD133	CCA GCG GCA GAA GCA GAA CGA	GTC AGG AGA GCC CGC AAG TCT	186
Sirt1	GCA GGT TGC AGG AAT CCA AA	CAC GAA CAG CTT CAC AAT CAA CT	101
GAPDH	TGC CAC TCA GAA GAC TGT GG	TTC AGC TCT GGG ATGA CCT T	129
CD90	GCT GGA TGG GCA AGT TGG T	TGA CAG CCT GCC TGG TGA A	75
TGF-β	GCT AAT GGT GGA CCG CAA CAA C	CAC TGC TTC CCG AAT GTC TGA C	100
IL-1α	AGA CCA TCC AAC CCA GAT CA	TGA TGA ACT CCT GCT TGA CG	87
IL-10	CAC TGC TAT GTT GCC TGC TC	TGT CCA GCT GGT CCT TCT TT	174
MCP-1	ATG CAG GTC TCT GTC ACG CTT CTG GGC	CTA GTT CTC TGT CAT ACT GGT CAC	447
IL-8	CCC CCA TGG TTC AGA AGA TTG	TTG TCA GAA GCC AGC GTT CAC	113
IL-1	GAC CTG TTC TTT GAG GCT GAC A	CTC ATC TGG ACA GCC CAA GTC	78
TNF-α	AAA TGG GCT CCC TCT CAT CAG TTC	TCT GCT TGG TGG TTT GCT ACG AC	111
AFP	GTC CCT CCA CCA TTC TCT GA	GGT CTT TGC AGC ACT TCT CC	193
IL-6	TAG TCC TTC CTA CCC CAA CTT CC	TTG GTC CTT AGC CAC TCC TTC	76
IFN-γ	AGG CCA TCA GCA ACA ACA TAA GTG	GAC AGC TTT GTG CTG GAT CTG TG	140

表注：IL-1α：白细胞介素1α；MCP-1：单核细胞趋化蛋白1；IL-6：白细胞介素6；TNF-α：肿瘤坏死因子α；IL-10：白细胞介素10；IL-1β：白细胞介素1β；IL-8：白细胞介素8；TGF-β：转化生长因子β；IFN-γ：γ干扰素。

主要观察指标：①肝癌诱导过程中肝癌干细胞标志的表达情况。②肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关ED2和炎症因子的表达变化情况。③Kupffer相关炎症因子和肝癌干细胞标志的相关性。
统计学分析：对研究所得数据利用SPSS 18.0软件进行处理，肝癌诱导过程中Kupffer细胞相关ED2和炎症因子的表达变化情况均予以单因素方差分析和Tukey多重比较，Kupffer相关炎症因子和肝癌干细胞标志的相关性进行Pearson检验。检测P值，如果经检测P < 0.05，则提示经比较两组数据间差异有显著性意义。

讨论

二乙基亚硝胺(DEN)诱导的动物模型能够很好地模拟人的肝癌发生过程，经历了从肝炎、肝纤维化、肝非典型性增生、肝硬化到肝癌的病理过程，因此本实验采用DEN化学诱导肝癌的大鼠模型来观察肝癌发生发展过程中肝癌干细胞标志物的变化。
肿瘤微环境的稳定是保持细胞正常增殖、分化、代谢的重要条件，对肿瘤的发生、发展、转移以及提高肿瘤患者的生活质量起着非常重要的作用[4]。在免疫系统中，Kupffer细胞是数量最多的巨噬细胞，可以释放出大量各种各样的炎症因子，并参与到肿瘤的发生以及发展过程中^[18-24]。本次研究过程中，在分析Kupffer细胞所释放的炎症因子与肝癌干细胞相关标志物在肝癌的发生、发展中呈现出的表达情况以及相关性的过程中，首先构建动物实验模型。通过利用DEN溶液对模型组大鼠进行连续24周的饲养，最终诱导形成肝癌，1-24周分别模拟了肝癌发生以及发展的整个过程，其中，1-12周为炎症反应期，13-16周为肝增生纤维化期，17-20周为肝硬化形成期，21-24周为肝癌形成期。本次研究结果显示，模型组肝癌诱导过程中，ED2表达呈现出逐渐增多的情况，对各组的ED2阳性细胞分数进行计算和比较可得，肝癌诱ED2阳性细胞分数呈现出不断上升的情况。较之健康对照组，模型组ED2在诱癌第12，16，20，24周的表达均出现显著升高的情况。经定量PCR检测，肝癌诱导过程中，肿瘤坏死因子α、转化生长因子β、MCP-1、白细胞介素6均呈现出明显上升的情况。较之健康肝脏组织，肝癌组织中转化生长因子β、MCP-1、白细胞介素6表达显著偏高。即表明，Kupffer细胞所释放的炎症因子与肝癌的发生以及发展之间存在十分密切的联系，通过释放各种炎症因子，积极的参与肝癌的发生与发展过程中[25-26]。其中，在肿瘤期初的发生阶段，受到持续性慢性炎症的影响，肿瘤干细胞开始发生转化，为肿瘤的始动和发展产生极大的促进作用^[27-33]。而在肿瘤的发生过程中，各种炎性细胞和肿瘤干细胞会互相影响，并形成复杂的调控网络，对肿瘤的发生产生作用[34-39]。随着是各种炎症因子和肿瘤细胞的不断互相作用，导致各种肿瘤相关炎症的出现，从而对肿瘤血管的形成以及侵犯和转移等产生影响^[40-42]。研究结果还显示，经定量PCR检测，肝癌诱导过程中CD90 中呈逐渐上升的情况，较之健康肝脏组织，肝癌组织中CD90上升更明显。CD133呈现出一定升高趋势，但经单因素方差分析其结果无明显变化。在诱癌过程中，其它肝癌干细胞标志物均未出现明显改变。且经Pearson相关性分析，MCP-1、转化生长因子β、白细胞介素6与CD90的表达之间呈显著正相关。即提示，Kupffer细胞所释放的部分炎症因子与肝癌干细胞标志之间存在一定的相关性，一些炎症因子会对肿瘤干细胞发挥出重要的调控作用，并对肝癌的发展与发展产生十分重要的影响。
综上所述，肿瘤的发生和发展与炎症之间存在十分密切的联系，而Kupffer细胞释放的一些炎症因子和肿瘤干细胞标志CD90上调之间呈显著正相关，表明Kupffer细胞可以积极的促进肝癌的发生。因此，临床对肝癌患者进行治疗的过程中，可以通过对炎症的有效控制，将Kupffer细胞作为潜在靶点，更好的提高临床治疗的有效性，改善预后效果。