生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.008

中国组织工程研究

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生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

刘振宁¹，韩长旭²，赵敏1

¹中国医科大学附属盛京医院急诊科，辽宁省沈阳市 110004；²内蒙古医学院第二附属医院关节镜与运动医学外科，内蒙古自治区呼和浩特市 010030

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 赵敏，博士，教授，中国医科大学附属盛京医院急诊科，辽宁省沈阳市 110004
作者简介:刘振宁，男，1981年生，辽宁省大连市人，汉族，2013年中国医科大学毕业，博士，讲师，主治医师，主要从事干细胞与组织工程研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81171793)；辽宁省教育厅高等学校科学研究一般项目(L2014300)

Chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 cultured on the type I collagen scaffold

Liu Zhen-ning¹, Han Chang-xu², Zhao Min¹

¹Department of Emergency Medicine, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China; ²Department of Arthroscopy and Sports Medicine, Second Hospital of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010030, Inner Mongolia Autonomous Region, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Zhao Min, M.D., Professor, Department of Emergency Medicine, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
About author:Liu Zhen-ning, M.D., Lecturer, Attending physician, Department of Emergency Medicine, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, Liaoning Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81171793; the Science Research Plan of Liaoning Province Education Administration, No. L2014300

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期实验中发现生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化，但在复合Ⅰ型胶原支架的体外培养条件下其向软骨细胞分化的能力尚未见研究报道。
目的：探讨生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架向软骨细胞分化的能力。
方法：从兔脂肪组织中分离培养脂肪干细胞，使用倒置相差显微镜观察细胞形态，使用免疫荧光对其表型进行鉴定。在复合Ⅰ型胶原支架条件下，加入外源性生长分化因子5对脂肪干细胞向软骨细胞进行诱导，在诱导14 d时，采用苏木精-伊红染色和扫描电镜对诱导的细胞进行形态学观察。在诱导7，14和21 d时，采用反转录PCR方法检测诱导的细胞的Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达情况。
结果与结论：原代脂肪干细胞贴壁生长，呈梭形、多角形分布，细胞表面抗原CD44、CD49d 阳性，CD106 阴性。生长分化因子5诱导的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架黏附良好，增殖能力旺盛，细胞表面存在着大量的细胞外基质分泌，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达水平明显增加。说明生长分化因子5能够成功诱导复合Ⅰ型胶原支架的脂肪干细胞成软骨细胞分化。

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 生长分化因子5, 支架, 胶原, 软骨细胞, 细胞分化, 组织工程学, 生物相容性材料, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Growth differentiation factor-5 can induce adipose-derived stem cells into chondrocytes in our previous studies, but it has not been reported that the adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 can differentiate into chondrocytes on the type I collagen scaffold.
OBJECTIVE: To investigate the chondrogenic differentiation ability of adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 cultured on the type I collagen scaffold.
METHODS: Adipose derived stem cells were isolated from rabbit adipose tissue, the cells morphology was observed using inverted phase contrast microscope and the phenotypes were identified using immunofluorescence. The exogenous growth differentiation factor-5 was added to the cultural media with the type I collagen scaffold so as to induce the chondrogenic differentiation. The cells morphology was observed using hematoxylin-eosin staining and scanning electron microscope after the induction by growth differentiation factor-5 for 14 days. Meanwhile, the type II collagen and aggrecan mRNA expressions of the induced cells were measured using RT-PCR after the induction by growth differentiation factor-5 for 7, 14, and 21 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary cultured adipose-derived stem cells proliferated adherently with the fusiform and polygonal distribution under inverted phase contrast microscope. The positive CD44, CD49d and negative CD106 were detected by immunofluorescence. The adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 were well adhered to the type I collagen scaffold and strongly proliferated. The large amounts of extracellular matrix existed on the surface of the induced cells under scanning electron microscope. RT-PCR agarose gel electrophoresis indicated that the type II collagen and aggrecan mRNA expressions of the adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 with the type I collagen scaffold were significantly increased. Growth differentiation factor-5 can successfully induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells cultured on the type I collagen scaffold.

Key words: Collagen Type I, Stents, Growth Differentiation Factors, Chondrocytes

中图分类号:

R394.2

刘振宁，韩长旭，赵敏. 生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.008.

Liu Zhen-ning, Han Chang-xu, Zhao Min. Chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 cultured on the type I collagen scaffold [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.008.

图/表（结果） 2

参考文献

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引言

材料方法

设计：对比观察实验。
时间及地点：于2007年10月至2012年8月在中国医科大学基础医学院组织工程研究室完成。
材料：
实验动物：清洁级健康3个月龄日本大耳白兔10只，雌雄不分，体质量2.5-3.0 kg，由中国医科大学动物部提供。实验动物许可证号：SCXK(辽)2003-0013。常规饲料饲养，自由取食和饮水，房间温度(25±5) ℃、湿度40%-60%，人工照明暗各12 h。实验符合动物伦理学的要求并经过中国医科大学动物伦理学委员会批准

兔脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原蛋白支架分化使用的主要试剂及仪器：
试剂及仪器	来源
高糖DMEM	Gibco, Invitrogen，US
标准胎牛血清	四季青，中国
生长分化因子5	PeproTech Inc, US
丙酮酸钠	Amresco，US
L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、抗坏血酸、胰蛋白酶、地塞米松、胰岛素	Sigma，US
Trizol	Invitrogen，US
Genefinder、100 bp DNA Ladder Marker、反转录PCR试剂	Takara, Japan
琼脂糖	华美生物有限公司，中国
Ⅰ型胶原支架	西安生物技术有限公司，中国
OCT冰冻切片包埋剂	Sakura，US
倒置显微镜，光学显微镜	日本Olympus公司
EiKO IB-5型离子溅射仪	日本EIKO公司
扫描电镜	日本日立公司

方法：
兔脂肪干细胞的分离、培养与传代：日本大耳白兔用速眠新0.2 mL/kg肌注，无菌条件下，取颈背部皮下脂肪官4-6 mL，尽量剔除筋膜血管，然后立即放入盛有PBS的小瓶中。将所取脂肪组织用PBS浸泡、冲洗5-7次，以去除红细胞，用眼科剪用充分剪碎至1 mm³体积大小后置入50 mL锥形瓶中，加入五六倍体积的0.1%的Ⅰ型胶原酶，37 ℃，水浴震荡消化50-70 min。加入等体积的高糖DMEM(含体积分数15%胎牛血清+双抗)终止消化。1 500 r/min，4 ℃离心10 min，倾去上层脂肪及上清。沉淀用约5 mL高糖DMEM(含体积分数15%胎牛血清+双抗)培养基悬浮，加入10-15 mL氯化铵(0.16 mol/L)，混匀后室温静止10 min裂解红细胞。1 500 r/min，4 ℃离心10 min，弃去上清，沉淀用10-15 mL高糖DMEM(含体积分数15%胎牛血清)悬浮沉淀，200目滤网过滤。将滤液1 500 r/min，4 ℃离心10 min，去上清，加入7-10 mL高糖DMEM(含体积分数15%胎牛血清+双抗)悬浮沉淀，接种于100 mL细胞培养瓶中，置入37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度培养箱中培养^[6]。48-72 h后首次换液，去除未贴壁细胞，之后每两三天换液1次，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化和生长状况。5-7 d以后细胞融合至80%-90%时，倾倒培养液，PBS冲洗2次倾倒，加入0.25%胰酶+0.02%EDTA细胞消化液约2 mL，轻轻摇晃培养瓶，并在倒置显微镜下观察，见胞质有回缩，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，立即加入含体积分数15%胎牛血清的高糖DMEM的培养基终止消化，用吸管轻轻吹打瓶底，倒置显微镜下观察细胞完全浮起后，按1∶2或者1∶3比例传代接种于100 mL培养瓶，放置于培养箱中继续培养。
脂肪干细胞的鉴定：取第3代细胞爬片，使用免疫荧光方法检测细胞表型抗原标记CD44，CD49d，CD106。以不加一抗的细胞爬片作为空白对照。细胞爬片经过PBS漂洗，多聚甲醛固定30 min，蒸馏水洗10min。含体积分数3% H^₂O₂的PBS室温覆盖5 min，PBS冲洗3次，每次2 min。再加山羊血清封闭液室温30 min。去封闭液，加鼠抗人CD44，CD49d，CD106(1 mg/L)，4 ℃过夜。去除一抗，PBS冲洗2次，每次10 min。加山羊抗鼠二抗反应液 (1∶200)，室温1 h。去除二抗，PBS冲洗2次，每次10 min。滴加SABC-FITC(1∶100)，室温避光30 min。PBS冲洗4次，每次5 min。甘油封固，荧光显微镜下观察细胞膜情况。
软骨细胞诱导液的配制：按照高糖DMEM(13.5 g/L)，胎牛血清(体积分数1%)，牛血清蛋白(1.25 mg/L)，丙酮酸钠(110 mg/L)，胰岛素(6.25 mg/L)，地塞米松(39.25 mg/L)，维生素C磷酸盐(37.5 mg/L)，L-脯氨酸(46 mg/L)，L-谷氨酰胺(50 mg/L)的配方配制成不含细胞因子的不完全诱导液^[10]，0.22 μm过滤除菌，使用时加入适量生长分化因子5使其终浓度为100 μg/L^[9]。
细胞接种：将已经消毒的Ⅰ型胶原支架制备成5 mm× 5 mm×2 mm大小，放置于24孔培养板内，使用高糖DMEM浸泡6 h，去掉DMEM，尽量将支架中的DMEM溶液去掉，使之能容纳更多的细胞。
取第3代原代脂肪干细胞消化，制成细胞浓度为1×10¹⁰ L^-1单细胞悬液。取150 μL细胞悬液，小心均匀滴加于材料的上方，放置于37 ℃，体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱中培养1 h。然后缓慢加入适量含体积分数15%新生牛血清的高糖DMEM，放置于37 ℃，体积分数5%CO₂，饱和湿度的培养箱中培养过夜。次日，更换诱导培养液，每孔加入2 mL生长分化因子5浓度为100 μg/L软骨诱导培养液，每3.5 d换液。
冰冻切片的制备：诱导培养14 d后，取出细胞支架复合物，0.1%PBS漂洗1次，40 g/L多聚甲醛固定2 h，30%蔗糖溶液沉糖过夜。将取出的标本完全浸没于OCT包埋剂中，放置于-25 ℃ 20 min，连续切片，厚度为10 μm，黏附于载玻片上。
苏木精-伊红染色：取10 μm切片，PBS漂洗1次，苏木精浸染10 min。移入自来水中，洗去苏木精和浮色，体积分数1%盐酸乙醇分化3 s，流水洗涤30 min。伊红浸染15 min，移入蒸馏水中，洗去伊红浮液，并用滤纸擦净载玻片上的多余染料。晾干，中性树胶封固，光学显微镜下观察。
扫描电镜观察：诱导培养14 d后取出支架材料，浸入生理盐水中超声清洗5-10 min。体积分数4%戊二醛固定 24 h。体积分数1%饿酸后固定2 h。梯度丙酮脱水。梯度醋酸异戊酯置换。临界点干燥。EiKO IB-5型离子溅射仪真空喷镀金膜。扫描电镜观察。
反转录PCR检测：分别取使用生长分化因子5 (100 μg/L)诱导7 d、14 d和21 d时的脂肪干细胞，提取RNA，经RT-PCR提取测定mRNA的表达。根据参考文献[11]报道和GeneBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)所公布的兔Ⅱ型胶原、蛋白多糖mRNA完全基因序列，采用primier5.0设计软件(加拿大Premier公司)设计引物序列，并在NCBI中的Blast程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST/)进行核酸序列相似性比较和引物特异性分析。引物如下：

RT-PCR引物：
基因	Genbank号	引物序列	长度(bp)	退火温度(℃)
Ⅱ型胶原	D83228	F: 5’-GCC TCC CAA CAC TGC CAA C-3’ R: 5’-GGA GCA GGG CCT TCT TGA G-3’	141	58
蛋白多糖	L38480	F: 5’-GAG ATG GAG GGT GAG GTC-3’ R: 5’-ACG CTG CCT CGG GCT TC-3’	443	49
β-actin	AF309819	F：5’-CCA TCT ACG AGG GCT ACG C-3’ R：5’-GGA AGG AGG GCT GGA ACA-3’	309	56

采用Trizol试剂盒提取成软骨诱导的细胞总RNA。PCR反应管中，依次加入2 μL MgCl2，1 μL 10×反转录缓冲液，3.75 μL去RNA酶水，1 μL dNTP混合物，0.25 μL RNA酶抑制剂，0.5 μL AMV RT，0.5 μL Oligo，0.5 μL RNA，共计10 μL。混匀短暂离心，PCR仪(美国Sigma公司)上设置 50 ℃，30 min；5 ℃，5 min，反应产物cDNA放存于-20 ℃。在PCR反应管中加入下列试剂：4 μL 5×PCR缓冲液， 7.9 μL去RNA酶水，0.1 μL Taq酶，2 μL Primer-F(工作液)，2 μL Primer-R(工作液)，4 μL cDNA，共计20 μL。混匀后短暂离心，置于PCR仪中，按照以下参数设计PCR反应条件：预变性94 ℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，共计30个循环。取上述5 μL PCR扩增产物和100 bp DNA Ladder Marker，与1 μL Loading Buffer混匀后，加入1.5%琼脂糖凝胶电泳梳孔中，在1×TAE电泳缓冲液中，150 V，电泳30 min。凝胶成像系统照相观察。
主要观察指标：倒置相差显微镜镜下观察培养细胞形态，使用免疫荧光方法对脂肪干细胞表型鉴定；采用苏木精-伊红染色和扫描电镜观察胶原支架与脂肪干细胞的复合情况；RT-PCR方法检测在复合Ⅰ型胶原支架条件下生长分化因子5诱导的脂肪干细胞Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达水平。
统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件包进行分析。数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P < 0.05 为差异有显著性意义。

讨论

脂肪干细胞作为种子细胞在软骨组织工程应用研究方面备受关注。外源性生长因子、共培养、支架材料等均可以作为诱导脂肪干细胞向软骨细胞方向分化的条件。许多外源性生长因子包括转化生长因子β、胰岛素样生长因子1、骨形态发生蛋白等对脂肪干细胞增殖和分化具有十分重要作用^[12]。生长分化因子5是骨形态发生蛋白家族重要成员之一，又称之为骨形态发生蛋白14。生长分化因子5以同源二聚体的形式激活骨形态发生蛋白Ⅰ型受体、骨形态发生蛋白Ⅱ型受体和激活素受体Ⅱ，再通过Smad将信号传到核内，调节基因表达^[13]。在长骨发育过程中能够促进间充质细胞聚集和软骨发生，促进软骨细胞合成代谢，增加软骨细胞合成特异性细胞外基质氨基葡糖多聚糖，维持软骨表型和自稳状态。外源性的使用生长分化因子5可以诱导脂肪干细胞表达Ⅱ型胶原蛋白和蛋白聚糖，具有软骨细胞的生物学功能，向软骨细胞分化[9]。
细胞培养的外界环境对于种子细胞生长分化起到十分重要的作用。传统的二维培养方法存在一些缺点：①贴壁的表面积有限，细胞产量低。②代谢产物逐渐累积，排出不及时易引起细胞生长不良甚至退化。③细胞离开了体内与细胞外基质共同构成的三维立体结构，生物学行为受到影响，容易变异。在三维培养环境中，可以能容纳高密度的细胞，有助于细胞黏附、增殖，有利于细胞间信号传递，为维系细胞的代谢活动提供适宜的微环境^[14]。此外，三维培养可使细胞外基质含量提高，增强所培养的细胞活性和功能，有助于软骨细胞表型的维持^[15]。若软骨细胞在动态的应力环境中三维立体培养，则可以明显提高分化的质量和效率，则对于软骨分化有非常重要的作用^[16]。
在三维培养中，细胞支架材料的选择是软骨组织工程研究的一个重要因素^[17]。目前国际上应用于软骨组织工程研究的支架材料主要分为2类：一类是人工合成的高分子材料，如聚乙交酯、聚丙交酯及其共聚物聚乳酸-羟基乙酸等，其具有良好的机械性能并能促进种子细胞的黏附、增殖和分化^[18]，但是其在降解过程中可以产生的乳酸和羟基乙酸等酸性物质，导致局部pH值急剧下降，引发无菌性炎症反应^[19]。另一类是天然材料，如胶原、纤维蛋白、壳聚糖等，它们大多自细胞外基质成分中提取，其抗原性较弱，不易引起排斥反应，并有良好的组织相容性、亲和性和结合力^[20]，但机械强度较差^[21]。因此用细胞外基质成分作为软骨组织工程种子细胞支架材料，最为接近软骨细胞的生长微环境，有利于细胞在支架上的黏附、生长和分化^[22]。
实验证明，三维螺旋结构的胶原蛋白可能是一种比较理想的选择。胶原蛋白是细胞外基质的组成部分，也是细胞代谢的场所和细胞附着的基本框架。胶原海绵作为细胞外基质可良好固守在细胞附近，而不像二维培养容易将细胞流失到培养液中，对细胞的增殖、分化和代谢有重要的调节作用。细胞支架的几何结构如平均孔径大小，对软骨细胞的增殖和基质的合成有着很大的影响，但对于胶原支架孔隙的最佳直径还没有定论^[23]。
目前所应用的胶原支架有2种类型：Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原支架。虽然软骨细胞在Ⅱ型胶原中沉积的氨基葡聚糖的含量要高于Ⅰ型胶原^[24]，但是Ⅰ型胶原中培养的软骨细胞可以维持很高的增殖能力，维持软骨细胞的表型，有利于细胞的侵入以及维持合成软骨特异性基质的生物学功能^[25]。在本实验中，采用Ⅰ型胶原作为细胞支架，在三维培养的条件下，研究生长分化因子5诱导脂肪干细胞向软骨细胞方向分化，结果显示二者的生物相容性良好，细胞增殖旺盛，在生长分化因子5的诱导之下，Ⅱ型胶原和蛋白多糖mRNA表达明显增加，说明诱导后的脂肪干细胞具有软骨细胞的部分生物学特征。
综上所述，脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架生物相容性良好，细胞增殖能力旺盛，扫描电镜观察发现经过生长分化因子5诱导以后的细胞表面分泌大量的细胞外基质颗粒，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA含量明显增加。上述结果证明生长分化因子5可以成功诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞分化。Ⅰ型胶原蛋白是软骨组织工程学较理想的生物支架材料，为下一步体外构建组织工程软骨奠定了良好的实验基础。

生长分化因子5诱导脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架成软骨细胞的分化

Chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells induced by growth differentiation factor-5 cultured on the type I collagen scaffold

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