两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.007

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 2993-2998.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.007

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两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较

闫成^1，2，薛改²，吴丽颖²，刘建芳²，侯艳宁²

¹解放军医学院，北京市 100853；²解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北省石家庄市 050082

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 侯艳宁，博士，主任药师，解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北省石家庄市 050082
作者简介:闫成，男，1985年生，河北省石家庄市人，汉族，2008年解放军第二军医大学毕业，主管药师，主要从事干细胞应用研究。
基金资助:
军队“十二五”重点课题(BWS11J002)，课题名称：成体间充质干细胞移植修复战创伤重要器官功能损害的前沿技术研究

Differentiation efficiency of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocytes under two kinds of liver homogenate supernatants: a comparative study

Yan Cheng^{1, 2}, Xue Gai², Wu Li-ying², Liu Jian-fang², Hou Yan-ning²

¹Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China; ²Department of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Hou Yan-ning, M.D., Chief pharmacist, Department of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China
About author:Yan Cheng, Pharmacist in charge, Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China; Department of Pharmacology, Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, Hebei Province, China
Supported by:
the Major Project of PLA during the Military Twelfth Five-Year Period, No. BWS11J002

摘要/Abstract

摘要：

背景：前期研究证明正常大鼠肝组织匀浆上清液可诱导人脐带间充质干细胞定向分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞，而肝纤维化大鼠肝组织匀浆上清液的诱导可行性及与前者诱导效果的比较尚不明确。
目的：比较正常肝组织及纤维化肝组织微环境诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的能力。
方法：采用腹腔注射3%硫代乙酰胺生理盐水溶液(200 mg/kg，2次/周，共4周)的方法制备SD大鼠肝纤维化模型，取肝纤维化大鼠及正常大鼠肝脏制备肝组织匀浆上清。将第3代人脐带间充质干细胞进行分组诱导培养：①标准对照组：加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。②纤维化肝组织匀浆组：加入含体积分数为10%胎牛血清及50 g/L纤维化肝组织匀浆的DMEM/F12培养基。③正常肝组织匀浆组：加入含体积分数为10%胎牛血清及100 g/L正常肝组织匀浆的DMEM/F12培养基。诱导开始后于倒置显微镜下观察各组细胞形态学变化；取标准对照组及诱导7 d的匀浆组细胞采用Western Blot法检测CK18、AFP、CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2的表达情况，采用ELISA法测定各组细胞培养液中白蛋白水平。
结果与结论：与标准对照组长梭形成纤维样细胞相比，诱导7 d时，肝纤维化匀浆组及正常匀浆组细胞形态变化明显，呈类圆形，胞体丰满。与标准对照组相比，两匀浆组细胞均可表达肝细胞标志物CK18和AFP。标准对照组细胞可表达少量CYP2E1，两匀浆组细胞表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2等肝细胞功能蛋白，且CYP2E1的表达量较标准对照组明显增加(P < 0.01)，而两匀浆组间上述蛋白的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。同时，两匀浆组细胞分泌白蛋白的能力较标准对照组亦明显增强(P < 0.01)，两匀浆组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。实验结果显示正常肝组织和纤维化肝组织微环境均可诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化，在达到相同诱导效果时，纤维化肝组织所需组织液浓度更低，提示纤维化肝组织微环境可能更有利于人脐带间充质干细胞向肝细胞分化。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 肝纤维化, 肝组织匀浆上清液, 微环境, 人脐带间充质干细胞, 诱导分化, 肝细胞, 细胞色素P450酶, 白蛋白

Abstract:

BACKGROUND: Previous studies have demonstrated that normal rat liver homogenate supernatant can induce human umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocyte-like cells with partial hepatocyte
functions. However, whether fibrotic liver homogenate supernatant can work or how the inducing effect is remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the differentiation potential of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocytes under the normal liver and fibrotic liver microenvironment in vitro.
METHODS: Liver fibrosis was induced in the SD rats by repeated intraperitoneal injections of 3% thioacetamide at a dose of 200 mg/kg body mass, twice a week for 4 weeks, and then fibrotic liver tissues and normal liver tissues were used to prepare liver homogenate supernatants. Passage 3 human umbilical cord mesenchymal stem cells were used and divided into standard control group (cells were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum), fibrotic liver homogenate supernatants group (cells were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 50 g/L fibrotic liver homogenate supernatants), normal liver homogenate supernatants group (cells were cultured in DMEM/F12 with 10% fetal bovine serum and 100 g/L normal liver homogenate supernatants). The morphological changes of the cells in each group were recorded under inverted microscope; the protein levels of CK18, AFP, CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6 and TPH2 were evaluated using western blot assay. Furthermore, the concentration of albumin in the cells was measured.
RESULTS AND CONCLUSION: After a 7-day inducement, the stem cells in liver homogenate supernatants groups lost their fusiform shape and changed into hepatocyte-like cells with the morphous of round shape. Compared with the standard control group, the hepatocyte-like cells in the two liver homogenate supernatants groups exhibited human hepatocyte biomarkers, CK18 and AFP. The standard control group cells could express a little amount of CYP2E1, while cells in the two liver homogenate supernatants groups could express CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2. Compared with the standard control group, the expression level of CYP2E1 in the two liver homogenate supernatants groups increased significantly (P < 0.01), and however, the relative levels of CYP3A4, CYP2E1, CYP2D6, TPH2 in the two liver homogenate supernatants groups showed no statistical significance (P > 0.05). At the same time, compared with the standard control group, the concentration of albumin in the two liver homogenate supernatants groups markedly increased (P < 0.01), but there was no difference between the two liver homogenate supernatants groups (P > 0.05). Experimental findings demonstrated that both of normal liver tissue and fibrotic liver tissue microenvironments could induce human umbilical cord mesenchymal stem cells to differentiate into hepatocyte-like cells. To achieve the same effect, compared with normal liver tissue, fibrotic liver tissue required lower concentrations, suggesting that fibrotic liver tissue microenvironment may be more conducive to differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocytes.

Key words: Liver Cirrhosis, Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cells, Hepatocytes, Cell Differentiation

中图分类号:

R394.2

闫成，薛改，吴丽颖，刘建芳，侯艳宁. 两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2993-2998.

Yan Cheng, Xue Gai, Wu Li-ying, Liu Jian-fang, Hou Yan-ning. Differentiation efficiency of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocytes under two kinds of liver homogenate supernatants: a comparative study [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2993-2998.

图/表（结果） 4

2.1 SD大鼠肝纤维化模型的建立造模组大鼠随着给药时间的延长逐渐出现精神萎靡，食欲不振，体型消瘦，毛发蓬乱且无光泽；对照组大鼠始终精神状态良好，活动正常，毛发有光泽，食量正常。4周时取两组大鼠肝组织切片进行苏木精-伊红染色，结果显示：对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列密集，核圆居中；造模组肝组织有大量炎性细胞浸润，部分肝细胞坏死，胶原纤维增生明显，肝小叶结构破坏，部分区域假小叶形成，见图1。
2.2 细胞形态学观察倒置显微镜下观察，标准对照组的人脐带间充质干细胞多为双突起的长梭形或扁平型成纤维样细胞，呈鱼群样排列。至诱导7 d时，纤维化匀浆组和正常匀浆组的细胞呈类圆形，形似肝细胞，胞体丰满，见图2。

2.3 人脐带间充质干细胞诱导前后肝细胞标志物AFP、CK18的表达情况 Western Blot结果显示：标准对照组细胞未见CK18、AFP表达，诱导7 d时两匀浆组细胞均可见以上蛋白表达(图3)，说明人脐带间充质干细胞在两种肝组织微环境下均可向肝细胞分化。

2.4 人脐带间充质干细胞诱导前后肝细胞功能蛋白的表达情况如图4所示，在选定的4种肝细胞功能蛋白中，标准对照组细胞仅可检测到CYP2E1的表达，而纤维化肝组织匀浆组和正常肝组织匀浆组的细胞均可表达CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2，且CYP2E1的相对表达量较标准对照组明显增加(P < 0.01，n=3)，两匀浆组上述蛋白的相对表达量差异无显著性意义(P > 0.05，n=3)。功能蛋白的出现提示细胞可能具备相应的肝细胞功能，说明人脐带间充质干细胞在两种肝组织微环境下分化形成的肝样细胞可能具备代谢药物及分解氨基酸的能力。

2.5 人脐带间充质干细胞诱导前后白蛋白分泌功能变化标准对照组细胞具备分泌白蛋白的能力，上清液中白蛋白水平为(7.92±0.32) mg/L。体外诱导7 d时，纤维化肝组织匀浆组的细胞上清液中白蛋白水平为(39.68±3.21) mg/L，正常肝组织匀浆组细胞上清液中白蛋白水平为(40.02±2.78) mg/L。与标准对照组相比，两匀浆组细胞上清液的白蛋白水平均明显增加(P < 0.01，n=6)，纤维化匀浆组与正常匀浆组相比差异无显著性意义(P > 0.05，n=6)，见图5。

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引言

材料方法

设计：动物模型制备，细胞形态学观察，分子水平检测，白蛋白含量测定。
时间及地点：于2014年5月至2015年3月在白求恩国际和平医院药剂科药理学实验室完成。
材料：
实验动物：21只健康雄性清洁级SD大鼠购自河北省实验动物中心，体质量180-220 g，合格证号：1407035。进行操作前先适应性饲养1周，实验过程对动物的处置符合动物伦理学要求，实验方案经白求恩国际和平医院动物伦理委员会批准。
人脐带间充质干细胞的获取：实验所用人脐带间充质干细胞为白求恩国际和平医院药剂科药理学实验室原代培养后冻存，获取及鉴定方法见文献[12]。将冻存的原代人脐带间充质干细胞于液氮中取出后迅速复苏，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基进行传代培养，取第3代细胞备用。

两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化所用主要试剂和仪器：
试剂和仪器	来源
DMEM/F12培养基和胎牛血清	美国Hyclone公司
硫代乙酰胺和3K15台式冷冻离心机	德国Sigma公司
抗CK18、抗AFP、抗CYP3A4兔多克隆抗体	天津美诺路生物技术有限公司
抗CYP2E1、抗CYP2D6、抗TPH2兔多克隆抗体	生工生物工程股份有限公司
抗β-actin鼠单克隆抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)	美国Proteintech公司
Elipse-Tis倒置显微镜	日本Nikon公司
白蛋白ELISA试剂盒	苏州卡尔文生物科技有限公司

实验方法：
SD大鼠的分组与处理：采用随机数字表法将21只SD大鼠随机分入对照组(7只)及造模组(14只)，造模组给予3%硫代乙酰胺生理盐水溶液腹腔注射，2次/周，每次 200 mg/kg，共4周^[13]，对照组腹腔注射生理盐水，注射时间同造模组。4周时处死所有存活大鼠，取肝脏进行病理学鉴定，纤维化肝组织及正常肝组织用于制备诱导培养基。
诱导培养基的制备：2%戊巴比妥钠麻醉后开腹，找到肝门静脉进行静脉留置针穿刺，用4 ℃预冷的生理盐水灌流30 min，然后取出肝组织，称取湿质量，按50 g/L(纤维化肝组织)及100 g/L(正常肝组织)加入DMEM/F12培养基(含体积分数为10%胎牛血清)，冰浴条件下手动匀浆。匀浆完毕后取组织液于4 ℃，15 000×g离心30 min，取上清，用0.22 µm的滤器过滤除菌，-70 ℃冰箱保存备用。
人脐带间充质干细胞向肝(样)细胞分化的诱导：取第3代人脐带间充质干细胞，以1×10⁸ L-1的细胞浓度接种于6孔板中，置于含有体积分数为5%CO₂、37 ℃饱和湿度培养箱中培养，待细胞长至80%汇合，吸弃培养液，加入诱导培养基，实验分组如下：①标准对照组(DMEM/F12+体积分数10%胎牛血清)。②纤维化肝组织匀浆组。③正常肝组织匀浆组。通过倒置显微镜观察并记录诱导前及诱导后人脐带间充质干细胞的形态。
细胞总蛋白的提取及Western Blots检测：收集诱导7 d纤维化匀浆组、正常匀浆组以及标准对照组的细胞，采用细胞裂解法提取细胞总蛋白，用BCA法进行蛋白定量。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，采用湿式电转印法将蛋白转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的Tween-PBS封闭2 h后，分别加入CK18(1︰500)、AFP(1︰500)、CYP3A4(1︰500)、CYP2E1(1︰500)、CYP2D6(1︰200)、TPH2(1︰200)、β-actin(1︰2 000)一抗，4 ℃摇动过夜，洗膜后加入对应二抗(1︰2 000)，孵育2 h后进行显影、曝光，胶片扫描后应用ImageJ软件进行灰度分析。
白蛋白分泌功能的测定：体外诱导7 d时，弃各组培养液，每孔加入无血清DMEM/F12培养液1.5 mL，在37 ℃、体积分数为5%CO2环境下继续孵育96 h，取各组上清液采用ELISA法测定白蛋白含量，测定方法参照试剂盒说明书。
主要观察指标：①苏木精-伊红染色检测肝组织病理学变化。②倒置显微镜下观察细胞形态学变化。③Western Blot检测肝细胞标志物及功能蛋白分子表达。④ELISA法检测细胞培养液中白蛋白含量。
统计学分析：数据以x±s表示，使用SPSS 13.0软件进行统计学分析，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间的比较采用成组t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

间充质干细胞作为成体干细胞的一员，具有来源广泛、增殖力强、多向分化能力以及低免疫原性等特点，其中，人脐带间充质干细胞由于可从医疗废弃物中获得、伦理道德限制小等问题，逐渐成为研究热点。间充质干细胞治疗终末期肝病的机制之一是其移植入血后可归巢至受损肝组织并向肝细胞分化，促进肝脏修复，这是一个受到诸多因素调控的复杂过程，其中的关键因素及分子机制尚未阐明。Spradling等^[14]认为，当组织中内源性干细胞缺乏时，形成的微环境会支持外源性干细胞的活性，此时外源性干细胞可能会通过占空、部分填充至组织或取代内源性干细胞的方式发挥作用。王韫芳等^[15]将PKH26标记的干细胞移植入肝功正常及肝损伤大鼠体内，结果表明在肝损伤大鼠体内干细胞可以向肝组织迁移并整合至肝细胞中，表达白蛋白、甲胎蛋白等肝细胞特异性标志物，相比而言，在肝功正常的大鼠肝组织中仅发现极少的外源细胞，而且这些细胞几乎不表达白蛋白、甲胎蛋白，提示损伤的肝脏环境不仅对干细胞有趋化作用，而且更有利于干细胞的定向分化。本实验通过体外模拟生理及病理两种组织微环境分别对干细胞进行诱导，为研究干细胞在体内的分化过程提供了一种更直观的方法，这一方法也被应用于神经病学、心脏病学、肾脏病学以及妇科学的相关研究中[16-19]。在本次实验中，含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12基础培养基可为人脐带间充质干细胞提供适宜的生长环境，肝组织匀浆的加入相当于添加了诱导干细胞分化的外源因素，预实验发现随着肝脏组织液浓度的上升，培养基对于干细胞分化的诱导效果先升后降，纤维化肝组织匀浆与正常肝组织匀浆各有一个质量拐点，前者是50 g/L，后者是100 g/L，故最终选择了这两个质量浓度进行比较。
对于诱导后分化细胞的鉴定，最直观的是细胞形态的变化。在加入诱导培养基后24 h，两匀浆组即可观察到人脐带间充质干细胞胞体的收缩，有向圆形转变的趋势，随着诱导时间的逐渐延长，匀浆组细胞最终呈现类圆形，形似肝细胞。AFP、CK18作为肝细胞的特异性标志物，被广泛用于鉴定干细胞向肝细胞的分化状态，两匀浆组的细胞能表达上述蛋白，说明人脐带间充质干细胞在两种肝组织微环境中均可向肝细胞分化。为进一步评价诱导后细胞的功能，实验检测了3种与肝细胞药物代谢能力相关的酶，分别是CYP3A4、CYP2E1和CYP2D6，它们都是细胞色素P450超家族酶类的重要成员，参与多种药物代谢。值得注意的是，标准对照组的细胞可表达少量的CYP2E1，人脐带间充质干细胞经体外诱导后，CYP2E1的相对表达量明显增加，并可表达CYP3A4和CYP2D6，这与干细胞的分化过程是相符的。TPH2，又称色氨酸加氧酶，是色氨酸分解代谢的胞内限速酶，在肝脏内持续表达，TPH2的出现说明细胞可能具有肝细胞的相应功能。与此同时，肝脏具备分泌白蛋白的能力，这对于维持人体内环境的稳定有着至关重要的作用。体外诱导7 d时，与标准对照组相比，两匀浆组细胞的上述能力均明显增强，进一步说明人脐带间充质干细胞经诱导后形成的肝样细胞具备肝细胞的功能。
综上所述，人脐带间充质干细胞在两种微环境下均可分化为具有部分肝细胞功能的肝样细胞，这些细胞具有类似肝细胞的形态，可以表达肝细胞标志物CK18、AFP及其功能蛋白CYP3A4、CYP2E1、CYP2D6、TPH2，并具备分泌白蛋白的能力。值得注意的是，在达到相同诱导效果的情况下，纤维化肝组织所需组织液浓度更低，从量效关系来讲，纤维化肝组织匀浆诱导人脐带间充质干细胞分化的效率更高。目前已有许多研究者采用在培养液中添加细胞因子的方法将干细胞诱导分化为肝样细胞，提示微环境中的诱导因子可能是干细胞分化的关键因素^[20-27]。基于实验所得到的结果，推测肝组织在外界因素的刺激下，肝星状细胞过度活化，合成的细胞外基质过度沉积，胶原组织大量形成，肝细胞变性坏死，肝脏代偿机制启动，形成肝纤维化，以上因素致使肝脏组织中的各种细胞因子水平发生变化^[28-30]，从而形成了更有利于人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的微环境，促进植入体内的干细胞对肝脏发挥修复作用。从另一个角度讲，既然制备的两种诱导培养基可以发挥类似的诱导作用，对比研究两者的组成成分可能有助于明确诱导干细胞向肝细胞分化的关键因子，这也是下一步要研究的内容。

两种肝组织匀浆上清液诱导人脐带间充质干细胞向肝细胞分化的比较

Differentiation efficiency of human umbilical cord mesenchymal stem cells into hepatocytes under two kinds of liver homogenate supernatants: a comparative study

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