脐带间充质干细胞对乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.006

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (19): 2986-2992.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.19.006

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脐带间充质干细胞对乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响

韩丽鑫¹，韩之波¹，耿洁²，王斌²，严淑玲²，毛爱斌²，韩忠朝^1，2

¹中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020；²细胞产品国家工程研究中心，天津市 300457

出版日期:2015-05-06 发布日期:2015-05-06
通讯作者: 通讯作者：韩忠朝，教授，中国医学科学院北京协和医学院血液病医院血液学研究所，实验血液学国家重点实验室，天津市 300020；细胞产品国家工程研究中心，天津市 300457
作者简介:韩丽鑫，女，1988年生，内蒙古自治区扎兰屯市人，蒙古族，2015年北京协和医学院毕业，硕士，主要从事间充质干细胞与肿瘤细胞相关的研究。
基金资助:
国家科技支撑计划(2013BAI01B09)

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on the growth of human breast cancer MCF-7 xenograft in a nude mouse

Han Li-xin¹, Han Zhi-bo¹, Geng Jie², Wang Bin², Yan Shu-ling², Mao Ai-bin², Han Zhong-chao^{1, 2}

¹State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China; ²National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China

Online:2015-05-06 Published:2015-05-06
Contact: Corresponding author: Han Zhong-chao, Professor, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China; National Engineering Research Center of Cell Products, Tianjin 300457, China
About author:Han Li-xin, Master, State Key Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, China
Supported by:
the National Science and Technology Supporting Plan of China, No. 2013BAI01B09

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有临床前和临床研究资料表明，间充质干细胞预防和治疗异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病、自身免疫性疾病以及糖尿病等具有显著疗效。但间充质干细胞植入后是否会促进体内肿瘤生长是其临床应用安全性的一个重要体现，目前这部分内容研究尚少。
目的：观察脐带间充质干细胞对人乳腺癌细胞MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响。
方法：随机抽取BALB/c裸鼠8只作为正常对照组，随机抽取乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠分为4组，每组8只，分别为模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。3个剂量组尾静脉注射脐带来源的间充质干细胞，分别为4×104、2×105和1×106个，共给予2次，间隔2周；正常对照组和模型对照组注射生理盐水。实验观察周期为6周。
结果与结论：模型对照组肿瘤体积呈持续增长趋势，观察结束后各剂量组与同期模型对照组动物相比，脐带间充质干细胞有抑制肿瘤体积及质量的趋势，但差异无显著性意义，病理组织学结果显示中高剂量组各有1只动物肺脏可见转移瘤。结果表明脐带间充质干细胞不促进MCF-7裸鼠肿瘤的生长，但可促进MCF-7裸鼠转移瘤的形成。

关键词: 干细胞, 脐带脐血干细胞, 脐带间充质干细胞, MCF-7, 裸鼠, 转移瘤

Abstract:

BACKGROUND: Mesenchymal stem cells reveal notable therapeutic effects on diabetes, graft-versus-host disease and autoimmune diseases after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Clinical safety is crucial for the clinical application of mesenchymal stem cells, and whether transplated mesenchymal stem cells can promote tumor growth in vivo or not is an important manifestation; however, fewer studies have been reported on this field.
OBJECTIVE: To observe the effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on growth of human breast cancer MCF-7 xenograft in a nude mouse in vivo.
METHODS: Eight BALB/c nude mice were randomly selected as controls, and nude mice with human breast cancer MCF-7 xenograft were randomly divided into four groups with eight mice in each group: model control group, low-dose group, middle-dose group and high-dose group. Three different doses of umbilical cord
mesenchymal stem cells (4×104, 2×105 and 1×106/mice) were given twice in the latter three groups, respectively, with an interval of 2 weeks. Healthy nude mice and MCF-7 tumor-burdened mice without transplantation were given normal saline. The experimental observation period was 6 weeks.
RESULTS AND CONCLUSION: The tumor size exhibited an increasing trend in the model control group. Umbilical cord mesenchymal stem cells could inhibit tumor growth, but there was no difference among different groups. Histopathological analysis showed that one mouse had lung metastases in either high-dose or middle dose-group. These findings indicate that umbilical cord mesenchymal stem cells cannot promote the tumor growth in a MCF-7 xenograft nude mouse, but they can accelerate the tumor metastases.

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Breast Neoplasms, Mice, Nude

中图分类号:

R394.2

韩丽鑫，韩之波，耿洁，王斌，严淑玲，毛爱斌，韩忠朝. 脐带间充质干细胞对乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(19): 2986-2992.

Han Li-xin, Han Zhi-bo, Geng Jie, Wang Bin, Yan Shu-ling, Mao Ai-bin, Han Zhong-chao. Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on the growth of human breast cancer MCF-7 xenograft in a nude mouse [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(19): 2986-2992.

图/表（结果） 4

2.1 脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定从脐带获得的细胞传至第3代后形态较为均一，呈梭形(图1A)。脐带间充质干细胞具有成骨和成脂分化能力(图1B，C)。经流式细胞仪检测脐带间充质干细胞CD90、CD73、CD105为阳性表达；而CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR则为阴性表达(图1D)。
以上实验数据可以证明：在体外特定的诱导条件下，人脐带间充质干细胞具有向骨细胞和脂肪细胞分化的能力。这些结果符合国际细胞治疗协会(ISCT)制定的标准^[24]，也表明获得的细胞为间充质干细胞。

2.2 脐带间充质干细胞对荷瘤裸鼠体质量的影响在整个观察期内，模型对照组动物体质量整体呈现增长趋势，第4天模型对照组动物体质量较正常对照组显著增加，持续至观察结束。各剂量组在第1次给予脐带间充质干细胞后的2周内，与正常对照组比较，体质量未见明显改变。
在第2次给予脐带间充质干细胞后，除低剂量组动物体质量较正常对照组明显增加外(P < 0.05，P < 0.01)，其余剂量组未见明显改变。
各剂量组与模型对照组比较，低剂量组动物在第1次给予脐带间充质干细胞后第10天体质量明显下降(P < 0.01)，一直持续到第16天恢复正常。中剂量组和高剂量组在给予后第4天体质量显著降低(P < 0.05)，持续2周左右。第2次给予脐带间充质干细胞后，除高剂量组体质量持续增长缓慢且在第16天明显降低外，其余各组动物体质量与模型对照组差异无显著性意义，见图2。

2.3 脐带间充质干细胞对荷瘤裸鼠肿瘤体积的影响在整个实验过程中，模型对照组肿瘤体积呈持续增长趋势，各剂量组肿瘤增长较同期模型对照组增长缓慢，低剂量组在第1次给予脐带间充质干细胞后第10天时肿瘤体积较同期模型对照组显著减小(P < 0.05)，中剂量组未见明显差异，高剂量组在第7，10，19，31天肿瘤生长较同期模型对照组明显减慢(P < 0.05，P < 0.01)，但在观察结束后，肿瘤体积与同期模型对照组相比，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.4 脐带间充质干细胞对荷瘤裸鼠肿瘤质量的影响观察结束后，将动物实施安乐死，剥离肿瘤结节并进行称质量，比较各组间肿瘤质量的差异。结果显示，各剂量组与模型组比较肿瘤质量有下降趋势，但差异无显著性意义，见图4。

2.5 病理检查结果
2.5.1 大体观察结果各脏器、组织无肉眼可见的异常病理改变。
2.5.2 显微镜观察结果模型对照组和各剂量组的肿瘤中心区可见大片状不规则坏死(图5A)，模型对照组和低剂量组各脏器未见肿瘤转移；中剂量组1只动物肺脏内可见2处单个癌细胞转移(图5B)，高剂量组1只动物肺脏内有2个转移的肿瘤结节，由致密的癌细胞构成，且癌细胞形态与接种的MCF-7肿瘤细胞形态相吻合，确认为转移瘤(图5C)。

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引言

间充质干细胞是来源于中胚层的多能干细胞，其具有自我更新和多向分化潜能，广泛存在于全身多种组织中，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为多种组织细胞如神经细胞[1]、成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等中胚层组织细胞，而且能够像内胚层组织细胞(如心肌细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。有研究比较脐带来源和骨髓来源间充质干细胞分化能力的差异，显示脐带间充质干细胞向成骨、成脂分化的速度比骨髓间充质干细胞快，但脐带间充质干细胞分化为脂肪细胞较骨髓间充质干细胞困难。
间充质干细胞具有组织修复、造血支持和免疫调控的功能。间充质干细胞的再生医学功能就是旁分泌细胞因子进行组织损伤修复，例如分泌神经细胞营养因子、促血管新生因子、造血支持因子、免疫调节因子、抗凋亡因子和趋化因子，以及细胞外基质成分如钙黏素和整合素等。目前已有临床前和临床研究资料表明，间充质干细胞预防和治疗异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病、自身免疫性疾病以及糖尿病等具有显著疗效[2-4]。目前，国际上已有多个间充质干细胞药物被批准上市[5]。
在发展中国家，肿瘤是引起死亡的第二位原因，而在发达国家，肿瘤已经成为人类疾病的头号杀手[6]。肿瘤的研究也越来越多，无论对肿瘤本身原癌基因和抑癌基因，还是对肿瘤微环境都有深入的研究进展[7]。然而，乳腺癌是在女性当中最常见的恶性肿瘤，并且其发病率随着年龄增加而增大[8]，大多患者发病在绝经期以后，然而15%-25%的患者发生在绝经前期[9]，他们中7%的发病年龄低于40岁[10]。有研究报道年龄低于35岁的乳腺癌患者比年长患者的预后效果差[11-15]，生存率小于5年的患者从1970年代的75.2%上升到现在的86.9%。这些数据表明对于年轻女性乳腺癌患者需要寻求更好的治疗方案[16]。
在临床和科研中最早使用的间充质干细胞主要来自骨髓，但骨髓来源间充质干细胞受年龄、取材、道德伦理和传统观念等问题的影响，使其临床应用受到限制。而脐带来源的间充质干细胞是间充质干细胞中新的来源[17-19]，与骨髓间充质干细胞具有相似的生理特征，但比骨髓间充质干细胞有更多优势，脐带间充质干细胞具有更强的体外扩增能力，病毒感染低风险性以及低免疫原性[20-22]。随着间充质干细胞临床应用和药物开发进入白热化，其安全性的研究成为越来越迫切的任务，其在应用中是否会恶性转化导致肿瘤发生？前期研究中发现脐带间充质干细胞在体外长期传代可以发生基因组不稳定，但并未发生恶性转化，将其注射到SCID鼠皮下也未发现形成肿瘤[23]。但间充质干细胞用到人体内是否会促进体内已有的肿瘤细胞增殖和转移呢？到目前为止，这类研究尚少。为了研究脐带间充质干细胞在动物体内是否会促进肿瘤生长，本实验以BALB/c裸小鼠皮下肿瘤模型为研究对象，观察多次给予脐带间充质干细胞后MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤的生长情况。

材料方法

设计：随机对照动物实验。
时间及地点：于2014年1月至2015年2月在天津市细胞产品国家工程研究中心完成。
材料：

脐带间充质干细胞植入后MCF-7荷瘤裸鼠肿瘤生长检测所用主要细胞、试剂及仪器：
细胞、试剂及仪器	来源
乳腺癌MCF7细胞	中国医学科学院实验动物研究所
DMEM/F12和IMDM干粉培养基、胰蛋白酶	Gibco公司
胎牛血清	ExCell Bio公司
小鼠抗人CD11b，CD19，CD29，CD34，CD45，CD73，CD90，CD105，HLA-DR抗体以及同型对照抗体	美国BD-Biosciences公司
地塞米松、IBMX、吲哚美辛、抗坏血酸磷酸盐、β-甘油磷酸	Sigma公司
成骨培养基、成脂培养基	Hyclone公司
胰岛素	Peprotech公司
倒置相差显微镜	日本Olympus公司
流式细胞仪	美国Becton Dickinson公司

实验动物：雌性BALB/c裸小鼠，4-6周龄，体质量为(16.26±0.83) g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，实验动物生产许可证号SCXK(京)2005-0013。
脐带标本：脐带来源于正常足月剖宫产产妇，由天津昂赛基因工程有限公司负责采集，经母血检测HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒均为阴性。
实验方法：
脐带间充质干细胞的分离和培养：将脐带组织用无菌盐水冲洗后，按参考文献[6]的方法分离脐带间充质干细胞，简而言之：用无菌组织剪将脐带组织剪成小组织块，使用胶原酶和胰酶消化，消化后的混合液体经200目滤网过滤后，接种于细胞培养瓶中，用含体积分数为10%胎牛血清的DF12培养基于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至80%融合时，胰蛋白酶消化细胞，按1︰3传代。实验建立了一套体外稳定培养扩增人脐带间充质干细胞的实验方法，所培养的间充质干细胞成分单一、细胞扩增迅速、生物学性状稳定，在体外能诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，为其进一步应用于组织损伤修复工程和细胞医学治疗提供了实验依据。
脐带间充质干细胞的鉴定：取第4代脐带间充质干细胞，常规消化后，按每个检测标记2×105细胞分管，每管加入5 μL相应抗体，抗体孵育30 min后，用1 mL的PBS重悬，离心后小心去除PBS，再用PBS重悬到400 μL，用BD公司FACSCalibur流式细胞分析仪的CellQuest Pro获取并分析数据。
成骨和成脂分化检测：选取第4代脐带间充质干细胞，常规消化离心后制成单细胞悬液，按2×104/孔接种于24孔板，待细胞融合达70%时更换成骨培养基或成脂培养基，然后每3 d换液1次，21 d后用茜素红染色检测成骨分化情况，用油红O染色检测成脂分化情况。
乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤的制备：将生长状态良好的体外培养的MCF-7细胞以1.0×10⁷/只皮下接种于2只BALB/c裸鼠，选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的荷瘤动物，无菌条件下取瘤，制备约3 mm3左右大小的肿瘤细胞块。
实验动物分组：将上述肿瘤细胞块于BALB/c裸鼠右侧腋窝皮下接种，当肿瘤生长至约50 mm3时，此时的裸鼠即为荷瘤乳腺癌细胞MCF-7裸鼠。随机抽取的BALB/c裸鼠8只作为正常对照组，随机抽取乳腺癌细胞MCF-7裸鼠分为4组，每组8只，分别为模型对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。
脐带间充质干细胞移植：低剂量组、中剂量组和高剂量组经尾静脉注射脐带间充质干细胞4×104、2×10⁵和1×10⁶个，共注射2次，间隔2周。正常对照组和模型对照组注射生理盐水，移植脐带间充质干细胞后观察周期6周。
主要观察指标：
体质量：脐带间充质干细胞移植前及移植后每隔 2 d测定一次动物体质量。
肿瘤结节体积：脐带间充质干细胞移植后，每隔2 d用游标卡尺测量肿瘤结节的长径、短径，根据公式：体积(mm3)=1/2×长(mm)×宽(mm)²，计算结节体积，并做详细记录，比较各组间肿瘤大小的差异。
肿瘤结节质量：实验期间，根据模型对照组肿瘤结节的直径大小决定观察周期为6周，观察结束后采用戊巴比妥钠麻醉，颈椎脱臼，将动物安乐死，剥离肿瘤结节并进行称质量，比较各组间肿瘤质量的差异。
病理学检查：实验结束后，大体解剖观察主要脏器包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏有无转移瘤出现，同时将上述组织及肿瘤结节用中性甲醛溶液作常规固定，制备石蜡包埋切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察。
统计学分析：采用GraphPad Prism软件完成统计处理，用t 检验方法统计。P ≤ 0.05为差异有显著性意义。 P ≤ 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

在间充质干细胞的临床应用与新药开发过程中，不管是何种来源的间充质干细胞，其安全性的研究是至关重要的，本文主要讨论的是脐带间充质干细胞是否促进体内肿瘤生长这一方面。实验结果表明，脐带间充质干细胞可以促进乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤转移。对于肿瘤生长情况而言，各剂量组在给予脐带间充质干细胞后，肿瘤体积较同期模型对照组增加缓慢，但差异无显著性意义，给脐带间充质干细胞各组肿瘤质量与模型对照组相比，随着剂量增加有抑制肿瘤增殖的趋势，但差异也无显著性意义。病理组织学检查结果显示中高剂量组各有1只动物肺脏出现转移瘤，提示脐带间充质干细胞可促进乳腺癌的转移，这与Yang等[25]研究结果类似，他们发现脐带来源的间充干细胞可以促进食管癌细胞的增殖和淋巴结的转移。
间充质干细胞对肿瘤生长是促进还是抑制，目前尚无定论。间充质干细胞为肿瘤的治疗提供了一个新的平台，它可以迁移至肿瘤的发生位点高效靶向地抗肿瘤[26-27]。绝大多数研究结果显示，间充质干细胞可以抑制血液系统肿瘤的增殖，例如脐带间充质干细胞可以抑制T细胞淋巴瘤[28]。同样，对于某些实体瘤，例如胶质母细胞瘤[29-30]、黑色素瘤[31]、肝癌[32]、Kaposi肉瘤[33]、Ewing sarcoma肉瘤[34]、结肠癌[35]、卵巢癌[36]、乳腺癌等[37]，间充质干细胞也可抑制其肿瘤细胞的增殖。
然而，在体内间充质干细胞对肿瘤的作用是复杂的，Ramasamy等[38]将间充质干细胞与肿瘤细胞共同输注免疫缺陷的小鼠体内，其肿瘤生长速度比单独输注肿瘤细胞快。Zimmerlin等[39]认为间充质干细胞具有促进肿瘤细胞增长的能力，将肿瘤细胞与骨髓或者脂肪细胞来源的间充质干细胞混合移植，肿瘤细胞表现出高增殖、丰富血管生成和高转移能力。对于乳腺癌而言，报道也不一致，Sasser 等[40]认为间充质干细胞可以促进乳腺癌细胞增殖，但对不同乳腺癌细胞作用是不同的。而Leng等[41]报道脐带间充质干细胞可以通过诱导乳腺癌细胞凋亡和抑制血管新生，从而抑制肿瘤生长。本实验的结果也显示随着移植脐带间充质干细胞剂量增加，与模型对照组相比肿瘤生长有被抑制的趋势。
间充质干细胞治疗肿瘤时，具有修复损伤的功能。在肿瘤损伤部位，间充质干细胞可以像基质细胞分化，例如纤维细胞、内皮细胞等[42-43]。而且间充质干细胞分泌一些细胞因子和基质蛋白来促进增殖和血管生成，例如血管内皮生长因子和血小板生长因子[44]。
然而，在脐带间充质干细胞促进肿瘤生长和肿瘤转移方面，有很多机制还尚未了解。Papetti等[45]认为脐带间充质干细胞促进MCF-7裸鼠移植瘤转移与肿瘤细胞血管生成有关。Hsieh等[46]认为脐带间充质干细胞可以通过分泌CXCL5来刺激血管生成。CXCL5具有促进人脐静脉内皮细胞增殖和血管形成的能力[47]。同时CXCL5的表达水平与肿瘤血管密度有关[48]。而Wang等[49]认为间充质干细胞通过分泌炎症因子白细胞介素6来促进肿瘤细胞生长。白细胞介素6是通过IL-6/JAK/STAT3信号通路起作用。磷酸化的STAT3激活靶基因的转录，这些靶基因具有促细胞增殖、细胞生长和抑制凋亡的作用。也有其他报道，乳腺癌细胞通过分泌白细胞介素6激活并且吸引间充质干细胞[50]，从而激活间充质干细胞的STAT3和MAPK信号通路，增强了迁移能力，用抗体抑制白细胞介素6的信号通路可以削弱由于间充质干细胞引起的迁移能力。
以上这些基础研究均关系到间充质干细胞临床应用的安全性。脐带已经成为一个主要的间充质干细胞来源，目前国内已有多家研究机构或企业其进行药物开发，用于临床治疗移植物抗宿主病。目前的基础与临床研究发现，移植后的供体间充质干细胞在受体体内存活时间极短，提示这实际上可能会更加安全[51-52]。药物的开发过程中安全性是最重要的，伴随而来的大规模间充质干细胞临床研究的开展，间充质干细胞的促肿瘤作用是不容忽视的潜在风险因素，从目前的研究结果看间充质干细胞对不同肿瘤作用存在差异，间充质干细胞这两种矛盾的实验结果并没有明确的定性，因此间充质干细胞对肿瘤细胞生长的作用还需进一步实验证实。但本研究结果提示，肿瘤患者在使用间充质干细胞时是需要谨慎，在研究初期应尽量避免将间充质干细胞应用于实体瘤患者。

脐带间充质干细胞对乳腺癌细胞系MCF-7裸鼠移植瘤生长的影响

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on the growth of human breast cancer MCF-7 xenograft in a nude mouse

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