囊胚培养液对小鼠胚胎的毒性：体外生殖辅助医疗器械安全性评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.026

摘要/Abstract

摘要：

背景：囊胚培养液是可以支持胚胎从受精卵发育到囊胚阶段的一种重要培养液，其安全性直接影响囊胚的质量。
目的：观察囊胚培养液对小鼠胚胎发育的影响。
方法：选用B6D2F1品系小鼠，将雌性小鼠进行超数排卵处理，与同品系雄鼠合笼过夜，次日收集1细胞期受精卵，在M16培养液中培养至4细胞期后，检查胚胎发育情况并转移到受试囊胚培养液中继续培养(实验组)，5 d后检查囊胚发育情况并计算囊胚形成率。同时，用含有内毒素的囊胚培养液M16培养小鼠受精卵，作为阳性对照组；用已被证实没有胚胎毒性的囊胚培养液M16培养液培养1细胞期受精卵，作为阴性对照组。
结果与结论：阳性对照组囊胚形成率为0，阴性对照组囊胚形成率为87.1%，实验组囊胚形成率为87.3%，实验组囊胚形成率大于80%，说明受试囊胚培养液可以支持小鼠受精卵正常发育到囊胚阶段，对胚胎没有毒性效应。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 囊胚培养液, 体外生殖, 医疗器械, 胚胎毒性

Abstract:

BACKGROUND: The blastula culture medium can assist the development of zygote from the fertilized egg to the blast blastula. The safety and quality of blastula culture medium directly influences the quality of blastula.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of blastula culture medium on the development of mouse embryos.
METHODS: In this study, B6D2F1 mice were used. The female mice were superovulated and mated with male B6D2F1 mice. One day later, the zygotes were collected and cultured in the M16 medium to 4-cell stage. Then, 4-cell stage embryos were transferred into the tested blastula culture medium (experimental group). After 5 days of culture, the forming rate of blastula was examined. Meanwhile, the M16 medium containing endotoxin was used to culture 1-cell mouse zygote (positive control group). The M16 medium with no embryo toxicity was used to culture 1-cell zygote (negative control group).
RESULTS AND CONCLUSION: The formation rate of blastula was 0 in the positive group, 87.1% in the negative control group, and 87.3% in the experimental group. From the results, the tested blastula culture medium could assist the 1-cell zygote growing to the stage of blastula, and the formation rate of blastula was above 80%. The tested blastula culture medium had no toxicity to the mouse embryo.

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Key words: Blastula, Reproduction, Reproductive Techniques, Assisted

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 1

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引言

体外受精胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)是一种辅助生殖技术，指分别将卵子与精子取出后，置于体外使其受精，用人工方法让卵子和精子在体外受精并进行早期胚胎发育，然后移植到母体子宫内发育而诞生婴儿，它是解决不育不孕症乃至实现优生优育的重要技术手段。1978年世界上第一个试管婴儿在英国诞生，被称为人类医学史上的奇迹，负责研究的Edowrds教授也因此在2010年获得诺贝尔医学奖。中国大陆首例试管婴儿于1988年3月在原北京医科大学第三医院诞生。随后首例赠胚试管婴儿于1988年6月在湖南湘雅医学院诞生。1995年2月6日中国首例冻融胚胎试管婴儿诞生。目前，在全国的生殖医学中心达上百家，且都能开展常规体外受精胚胎移植技术，且能保持稳定的成功率^[1-8]。

在辅助生殖治疗过程中，提高妊娠率和降低妊娠风险一直是医务人员追求的目标。体外囊胚培养技术是辅助生殖技术中很重要的组成部分，囊胚移植可以更好地选择胚胎发育潜力，同时单囊胚移植在不降低妊娠率的前提下可有效降低多胎妊娠风险。所以，囊胚移植逐渐在各个生殖中心得到广泛应用。对于体外囊胚移植来讲，获得高质量的囊胚是保证体外受精-胚胎移植种植率的关键，所以体外囊胚培养技术决定了囊胚的质量。在体外囊胚培养中，所用的培养液至关重要，这也是本研究之所以选择囊胚培养液作为研究对象的原因。

体外囊胚培养一般有两种方式，单一培养基培养和序贯培养。单一培养基培养是指囊胚培养过程中不更换培养基的培养方式，这种培养方式囊胚形成率低；序贯培养是指在囊胚培养过程的不同阶段更换不同类型的培养基。序贯培养的理论基础是在胚胎生长过程中，不同时期胚胎对培养液成分的要求是不同的，有研究表明2-细胞、4-细胞以后补充葡萄糖，囊胚率显著提高。

囊胚序贯培养技术应用于体外受精胚胎移植可显著提高胚胎种植率，在国内外已作为常规技术进行应用。序贯培养用的培养基必须满足胚胎发育不同时期的需求，在成分上有所区别。体外受精胚胎移植技术中的培养基分为两大类：①单一培养基：是指从配子受精至囊胚期使用成分相同的培养基。②序贯培养基：是指配子受精、卵裂期和囊胚期分别使用不同成分的培养基。囊胚培养基就是序贯培养基中的一种，可以支持受精卵在体外自4-细胞期发育到囊胚阶段的一种培养液，这类培养液的安全性直接影响着囊胚的质量^[9-22]。

除了囊胚培养液，在体外受精胚胎移植的过程中需要一系列的其他试剂类和器具类医疗器械来实现配子的获得、受精和发育等过程。液体类医疗器械，如取卵液、精子洗涤液、体外受精液、卵裂液、囊胚培养液，用于胚子保存的胚胎冷冻液、囊胚冷冻液、胚胎解冻液及用胚胎活检液等一系列产品。器具类医疗器械产品包括取卵针、囊胚培养用平板、取卵管等。近年来国内已有数十种相关产品出现，随着使用人群的不断扩大，产品的安全性问题会进一步加大。因此，制定相应的安全性评价检测方法已迫在眉睫^[23-25]。

小鼠胚胎实验是将1-细胞期的受精卵取出后，在体外进行一系列培养并按时观察胚胎的发育的实验，可以用来评价体外生殖辅助所用的产品是否对胚胎有毒性，是否可以支持胚胎的正常发育。本实验采用1-细胞鼠受精卵，用囊胚培养液培养囊胚形成期胚胎，观察其对小鼠胚胎发育的影响并计算形成正常囊胚的比率^[26-31]。本实验方法的建立能够评价体外生殖辅助医疗器械的安全性，是一个重要的检测方法。

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材料方法

设计：建立评价方法。

时间及地点：于2013年7月在中国食品药品检定研究院完成。

材料：

实验动物：本实验采用B6D2F1小鼠，雌性为7周龄，雄性为5月龄，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXX(京)2012-0001。

实验动物的管理：符合实验动物保护和使用规范制定的标准操作。每天供给小鼠饲料。每天充足供给清洁用水。饲料和饮水中的污染预计不会对实验结果有潜在的影响。动物饲养在不锈钢丝罩的塑料笼舍内，笼舍铺有木屑。每笼的标牌标明实验作业号、动物数量、实验编号、性别、动物编号和注射日期。每日监控室温，将室温控制在 20-25 ℃范围。每日监控室内湿度，相对湿度控制在40%-70%范围。光照应采用自动定时计控制12 h光照 12 h黑暗。

主要试剂：受试囊胚培养液(Sage in-vitro fertilization,批号：E076B)，M2培养基(Sigma，批号：SLBF4124)，M16 培养基(Sigma，批号：SLBF9619)，矿物油(Sigma，批号：#MKBG7544V)，孕马血清促性腺激素PMSG(Sigma，批号：FD13012664)，人绒毛膜促性腺激素Hcg(Sigma，批号：138752)，透明质酸酶(Sigma，批号：17364)。

设备：CO₂培养箱，透射显微镜，3 cm和6 cm培养皿，显微镊，眼科剪，移卵装置(SIGMA)，体式显微镜(奥林巴斯)。

实验方法：

雌鼠超数排卵：选择6-8周龄雌鼠，经腹腔注射孕马血清促性腺激素10 IU/只，48 h后经腹腔注射人绒毛膜促性腺激素10 IU/只，注射人绒毛膜促性腺激素当日雌鼠与同品系雄鼠合笼过夜。

准备培养微滴：培养胚胎的前1 d在35 mm细胞培养皿中做50 μL大小的液体微滴(按需制备)，表面覆盖组织培养油，在37 ℃、含体积分数6% CO₂饱和湿度的培养箱内预平衡至少3 h或过夜，但不超过18 h。

鼠胚采集：合笼第2天早上检查交配情况，选择可见阴道栓的雌鼠备用。

1-细胞胚胎收集：注射人绒毛膜促性腺激素后18-22 h后处死见阴道栓雌鼠，在输卵管壶腹部收集受精卵(图1)。

将收集到的絮状受精卵团放置到37 ℃提前预热好的透明质酸酶中，当胚胎周围的卵丘和颗粒细胞被消化分离后，立即转移、清洗，挑选出正常形态的受精胚胎，转移到培养微滴中，用于实验。

体外培养：将采用微滴法将收集到的鼠胚置于前1 d准备的微滴中，于在37 ℃、含体积分数6% CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

实验分组：将囊胚分3组培养，阳性对照组用含有 5 g/L内毒素的M16培养基，阴性对照组采用常规胚胎培养液M16，实验组采用受试囊胚培养液。因为本实验使用的囊胚培养液是支持受精卵从4-细胞期发育到囊胚期的培养液，所以，各组收集胚胎和培养至4-细胞期之前的步骤是一样的，在4-细胞期培养阶段开始有所不同。阳性对照组的4-细胞期小鼠胚胎是在含有5 g/L内毒素的M16培养基中进行培养；阴性对照组的4-细胞期胚胎在常规胚胎培养液中进行培养；实验组的4-细胞期小鼠胚胎是在受试培养液中进行培养。因此收集1-细胞鼠受精卵，培养至4-细胞期后转移至相应分组的培养液微滴中进行囊胚培养。

按照图2所示流程，将1-细胞鼠胚在预温的缓冲液M2中洗涤，之后将1-细胞鼠受精卵随机分成3组，分别为阴性对照组、阳性对照组和实验组。阳性对照组的胚胎数量为85个，阴性对照组胚胎数量为70个，实验组的胚胎为134个。将3组鼠胚在M16培养液中培养48h至4-细胞阶段，培养条件是37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的培养箱。阴性对照组鼠胚转移到M16培养液中继续培养，阳性对照组转移到含有内毒素的M16培养液中继续培养，实验组鼠胚转移到受试囊胚培养液中继续培养，直到培养的第5天上午，检查囊胚发育情况并计算囊胚率。图3为实验过程中小鼠胚胎各个阶段的形态图。

主要观察指标：对形成囊胚的受精卵比例进行计算。发育良好的囊胚，囊胚腔充分扩张，内细胞团大小适中，滋养层细胞连接紧密且大小均匀。发育差的囊胚，囊胚腔小，内细胞团小或无内细胞团，滋养层细胞稀疏。囊胚形成率超过80%即认为没有胚胎毒性。

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讨论

2010 年诺贝尔生理学或医学奖授予了“试管婴儿之父”罗伯特•爱德华兹。试管婴儿技术是一项影响深远的重要技术，为人类辅助生育技术带来了重大变革。一般来说，体外受精胚胎移植技术主要有以下步骤：诱发超排卵，取卵，取精，体外受精，胚胎移植。诱发超排卵主要目的是能获得多个健康成熟的卵子，采用药物促进的办法。取卵、取精后，将它们共同置于模拟人体内环境的培养基中，完成体外受精过程。待受精卵分裂至囊胚期胚胎后，移植到母体的子宫内，待胚胎着床后继续发育。在体外受精胚胎移植过程中，配子或者胚胎会接触不同种类的培养液和器械，需要对所接触的所有培养液和器械进行安全性评价，以保证对胚胎没有毒性^[1^，^5]。

囊胚培养液是用于在体外将受精卵从4-细胞期培养至囊胚期的培养液。囊胚移植是一种提高妊娠率和减少多胎发生的有效方法，为胚胎种植前遗传学诊断和人类干细胞的研究奠定了基础、提供了保障，从而促进了人类生殖健康及发育生物学的进展。囊胚形成在形态上经历了细胞融合、出现囊胚腔和囊胚腔扩张的过程，基因调控经历了从母体调节向胚胎调节的转换，发育潜能差及染色体异常的胚胎在未发育至囊胚时即停止发育，只有质量好的胚胎才有发育至囊胚的潜能，因此，囊胚培养可以有效筛选胚胎，从而提高囊胚的着床率。序贯培养法可以延长胚胎体外培养时间，以获得良好的囊胚进行移植，提高治疗成功率。序贯培养是一种新的体外培养方法，指按照早期胚胎发育的不同阶段中胚胎对环境成分的不同需要，配制的阶段系列培养液，进行序列更换，从而延长胚胎在体外的培养时间，增加体外筛选机会^[10-20]。在胚子获得，囊胚培养和囊胚植入人体的过程中，会用到各类医疗器械，此类产品的安全性直接关系着治疗是否成功，因此，制定相应的安全性评价检测方法已迫在眉睫。因为此类产品直接或者间接接触配子或者胚胎，所以必须评价此类产品对于胚胎发育的毒性。直接评价其对于胚胎的毒性可以直接反映产品的安全性，所以建立针对此类产品的胚胎毒性检测方法是十分必要的。除了囊胚培养液，体外生殖辅助医疗器械还包含其他培养液，洗涤液，冷冻解冻液和器具。

本研究所建立的实验体系可以为此类产品的检测提供借鉴。在体外受精胚胎移植的操作过程中需要一系列的试剂和器具来实现配子的获得、受精、发育等过程，这些产品是归为医疗器械管理的。本实验以囊胚培养液为例，建立了针对体外生殖辅助用培养液类医疗器械的胚胎毒性实验方法。采用1-细胞鼠受精卵，在相应的试剂中直接培养或孵育后培养，观察其对囊胚发育情况的影响并计算囊胚率，可为体外生殖辅助用医疗器械的安全性提供依据。本实验观察了1-细胞鼠受精卵发育到囊胚的过程中，受试囊胚培养液对鼠受精卵发育的影响。本实验方法可以观察受精卵发育到囊胚期的全过程。体外受精胚胎移植的操作不仅涉及培养液类产品，也涉及器具类产品，比如取卵针等。本研究的实验体系可以考察不同种类的供试品对鼠胚发育的影响。对于培养液类产品，根据供试品的使用方式和使用时间点对鼠胚进行接触处理；对于器具类产品，可以选择用M16培养基制备供试品浸提液，用供试品浸提液培养鼠受精卵，观察囊胚形成率；对于冷冻解冻液类产品，需要模拟冷冻解冻液的使用方法，将受精卵按照使用方法分别置于冷冻解冻液中，再置入M16培养基中观察囊胚发育情况。

在实验动物的选择方面，在鼠胚实验中收集胚胎用的小鼠，应具备遗传稳定、对药物敏感、且敏感性均一的特点，近交系小鼠和杂交F1代小鼠有以上特点，所以尽量选择近交系和F1代小鼠。国际上常用的F1代动物有：AKD2F、 BA2CF1、BCF1、BCBAF1、B6D1F1、CKAF1、B6D2F1、CBA/C57、CAF1等。以上动物品系都可用于鼠胚实验。

本实验能够评价生殖辅助医疗器械的安全性，但是也有局限。首先，对于囊胚的形态评价，实验人员往往有主观局限性，导致不同实验人员得出的结论不同；其次，囊胚形成率不能完全代表囊胚的活力和质量，所以，若想进一步明确囊胚的活力和质量，有必要对囊胚进行计数。一般采用对囊胚进行压片，染色和计数的方法。囊胚计数方法能够更准确的评价囊胚的质量，但是实验操作直接关系着观察效果，有必要进行标准化研究，本课题组在积极摸索囊胚计数的实验方法和实验条件。

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