胶原蛋白海绵交联工艺的优化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.16.020

摘要/Abstract

摘要：

背景：胶原蛋白材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，但在临床应用过程中也暴露出了机械强度低、耐降解性能差等问题。大量研究报道，通过适当的交联可以改善胶原蛋白材料的缺陷，调控其多孔网络结构、溶胀性和降解性。
目的：优化胶原蛋白海绵的碳化二亚胺交联工艺，探讨其最佳工艺条件。
方法：利用碳化二亚胺对胶原蛋白海绵进行交联改性，得到具有疏松、多孔网络结构的胶原蛋白海绵，同时采用正交实验对交联工艺进行优化，单因素中选择碳化二亚胺浓度(5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mmol/L)、交联时间(2，4，6，8，12，16，20，24 h)及交联温度(5，10，15，20，25，30，35 ℃)为实验因子，以孔径、孔隙率、吸水性、降解率来筛选胶原蛋白海绵交联的最佳工艺。
结果与结论：当碳化二亚胺浓度为50 mmol/L、交联温度为20 ℃、交联时间为6 h时，胶原蛋白海绵的各项性能最为优越，为最优工艺条件，其中平均孔径大小为105 μm，孔隙率为79.45%，吸水率为287.14%，降解率最优为15.04%(2 d)。表明通过对胶原蛋白海绵的交联改性，极大提高了海绵的吸水性能和耐降解性能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 胶原蛋白海绵, 创面修复, 交联, 单因素分析, 工艺优化, 吸水性, 生物降解性

Abstract:

BACKGROUND: Collagen materials have good biocompatibility and biodegradability, but also had some problems such as low mechanical strength, poor resistance to degradation exposed in the process of clinical application. Numerous studies have reported that proper crosslinking could improve the disadvantage of collagen materials, regulate porous network structure, swelling and degradation of collagen materials.
OBJECTIVE: To optimize carbodiimide crosslinking process of collagen sponge and determine the best process conditions.
METHODS: Collagen sponge was cross-linked by carbodiimide for the preparation of loose and porous collagen sponge. Meanwhile, we optimized the conditions of cross-linking, in which the selected concentration of carbodiimide was 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 mmol/L, linking time was 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24 hours, and linking temperature was 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ℃. We evaluated the best process conditions of collagen sponge through the aperture, porosity, water absorption, and degradation rate.
RESULTS AND CONCLUSION: The optimal conditions were carbodiimide concentration 50 mmol/L, crosslinking temperature 20 ℃, crosslinking time 6 hours. At this point, the average pore diameter of collagen sponge was 105 μm, the porosity was 79.45%, water absorption was 287.14%, and the degradation rate was 15.04% (2 days). The crosslinking of collagen sponge significantly improved its water absorption and degradation resistance.

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Key words: Collagen, Carbodiimides, Cross-Linking Reagents

中图分类号:

R318

王珩，喻洪流，陆金婷，赵颖 . 胶原蛋白海绵交联工艺的优化[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(16): 2567-2572.

Wang Heng, Yu Hong-liu, Lu Jin-ting, Zhao Ying. Crosslinking process optimization of collagen sponge[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(16): 2567-2572.

图/表（结果） 3

2.1 碳化二亚胺浓度对胶原蛋白海绵性能的影响在 5-50 mmol/L范围内，随着碳化二亚胺浓度的升高，胶原蛋白海绵的孔径逐渐变大；当碳化二亚胺浓度大于 50 mmol/L时，海绵的孔径无明显变化(图1A)，而孔隙率呈不断下降的趋势(图1B)。胶原蛋白海绵的吸水率随碳化二亚胺浓度的增大而减小(图1C)，交联剂浓度的提高与抗酶解能力呈现正相关性，当浓度大于50 mmol/L时，材料的降解率没有明显变化(图1D)。交联加强了胶原蛋白海绵各分子之间的作用，提升了材料的孔径，使胶原纤维间的聚集更为紧密，孔隙率有所下降，交联使得材料在微观上形成高度有序的互穿网络结构，胶原酶的分解作用开始只能在表面进行，而无法充分与胶原分子接触，从而减慢了胶原的降解。

2.2 交联时间对胶原蛋白海绵性能的影响从图2A可以看出，随着交联时间的延长，胶原蛋白海绵的孔径显著增大，交联反应8 h后，反应时间的进一步延长对材料的孔径影响不大。一开始随着交联时间的延长，胶原蛋白海绵的孔隙率有所降低，到12 h后逐渐趋于平衡(图2B)。同样的，从胶原蛋白海绵的吸水率和体外降解率(图2C，D)中也可以看出，随着交联时间的延长，一开始呈现下降的趋势，到一定时间(大约8 h)后趋于平衡，这有可能是因为交联时间超过8 h后胶原分子间已最大限度的形成交联键。

2.3 交联温度对胶原海绵性能的影响随着交联温度的升高，胶原蛋白海绵的孔径呈上升趋势，20 ℃后随着温度的升

高，胶原海绵的孔径无明显差异(图3A)。同样的随着交联温度的升高，交联度不断增大，胶原海绵的孔隙率和吸水率有一定幅度的降低(图3B，C)，等到一定的温度(20 ℃左右)，可能交联度达到最大值后，交联温度的提高对胶原蛋白海绵的孔隙率和吸水率影响并不明显。碳化二亚胺交联显著减缓了支架材料的降解，各组交联材料均表现出了较未交联组高的抗降解能力，20 ℃组抗降解能力较5 ℃组明显提高，而 20 ℃组和35 ℃组差异无显著性意义，表现了与孔隙率、吸水率变化相似的趋势(图3D)。总之，交联温度的升高可以增加分子运动速率从而显著提高交联速率，而随着交联的进行，自由氨基和羧基逐渐减少，使得在交联度达到最大值后，交联过程减慢，因此交联温度的进一步升高并未显著提高交联度，因而胶原蛋白海绵的各个性能也随之改变。

2.4 碳化二亚胺交联条件的优化

2.4.1 不同交联工艺胶原蛋白海绵的扫描电镜表征各海绵样品在交联后其微观结构规则而致密，都呈现出多孔的、有序排列的、互穿网络结构，见图4。通过孔径软件统计，海绵的孔径在50-150 μm之间。这种规则的多孔网络结构不仅提升了材料被细胞识别的能力，提高了它的生物相容性，更可以提高材料的抗降解能力^[10-11]。

从图4可以看出，由于交联剂的交联作用，增加交联剂碳化二亚胺的浓度和交联时间，加强了胶原分子链之间的作用，略微提升了海绵孔径；交联后的胶原海绵显示更为疏松的多孔网络结构，而纯胶原蛋白海绵则结构更致密些。随着交联浓度和交联时间的增加，材料的网络结构发生变化，孔径逐渐变大，多孔蓬松的结构减少，片状结构增加，这种结构可赋予海绵材料良好的吸水和保湿性能，为其作创面修复材料提供了良好的条件。

2.4.2 碳化二亚胺交联最优工艺^[12-13] 由表2可知，在碳化二亚胺浓度、交联时间、交联温度3个因素中，碳化二亚胺浓度对胶原蛋白海绵的平均孔径大小和降解率(2 d)的影响最大，交联时间对平均孔径大小的影响最小，交联温度最降解率的影响最小。影响平均孔径大小和降解率的最佳工艺略有不同。综合考虑工艺效率和最终成效，确定本实验最优工艺组合为A3B1C1，即碳化二亚胺浓度为50 mmol/L，交联时间为6 h，交联温度为20 ℃。通过此工艺制备得到的胶原蛋白海绵具有合适细胞生长、增殖的孔径大小，且其耐降解性能得到了显著提高。

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引言

胶原蛋白是细胞外基质最主要的成分，拉伸强度高，延展性低，具有类似真皮的形态结构^[1-2]，免疫原性低，具有良好的生物相容性^[3-4]。在创面修复中，胶原蛋白能促进成纤维细胞的增殖和分化，诱导成核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的聚集，促进毛细血管生长，进而加速组织再生和创面愈合，是良好的组织工程修复材料^[5]。目前，胶原蛋白基材料作为人体组织、器官的代替物被广泛用于人工皮肤、人工血管、人工骨骼、心脏瓣膜等领域^[6-7]。邱敏酶等^[8]研究了医用胶原蛋白海绵用于重度肝破裂创面的止血、修复效果，结果表明海绵能有效止血，与创面黏附力强，并能诱导肝创面肝细胞再生。Liu等^[9]将胶原蛋白制成的导管植入动物脊髓半横断的腔隙，伤后9个月在脊髓损伤处发现神经纤维通过胶原蛋白导管从头侧生长到尾侧。俞振立等^[10]发现胶原蛋白海绵可减少甲状腺腺叶切除后的渗出和出血，缩短切口愈合时间，同时由于降解快的特性，不会对甲状腺术后的颈部皮肤形态产生影响。尽管胶原蛋白以不同剂型应用于临床多个科室，但在实际应用过程中其也暴露出了机械强度低、耐降解性能差等问题^[11-13]。大量研究报道，通过控制支架密度或适当的交联可以改善胶原蛋白材料的缺陷^[14]。密度越低支架孔隙率就越大，促使更多的细胞向支架内部生长，支架的降解率就越高^[15]；通过交联改性方式可提高支架抗酶解的性能，降低降解速度，同时增强了胶原支架的机械性能，调控其多孔网络结构、溶胀性^[16-18]。

碳化二亚胺(1-ethyl-3-(3-dimethyaminopropyl) carbodiimide，EDC)是一类含有官能团-N=C=N-的化合物，其分子呈线性结构，能与胶原蛋白中的羧基和氨基发生交联反应，改善胶原蛋白材料的性能^[19]。一般情况下，碳化二亚胺与羟基琥珀酰亚胺联合使用，研究证明碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺交联的胶原无毒，生物相容性良好^[20-21]。Peter等^[22]用碳化二亚胺/羟基琥珀酰亚胺交联分别来自牛和马的胶原基质，改性后胶原材料的溶胀率、降解速率、形态稳定性和断裂强度都得到显著提高。徐新宇等^[23]研究表明在酸性条件下游离氨基酸中的羧基活性比较强，因此酸性环境更有利于交联反应的进行。

近几年，虽然有很多关于碳化二亚胺交联改性胶原蛋白的研究，但关于胶原蛋白海绵交联工艺的研究未见细化^[24-25]。本实验对胶原蛋白海绵的碳化二亚胺交联工艺进行了优化，探讨最佳工艺条件，以期得到性能更为优越的胶原蛋白海绵材料应用于组织工程修复领域。

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材料方法

设计：工艺研究。

表1 胶原蛋白海绵交联因素水平表L₉(3⁴)

Table 1 Level table of cross-linking factors of collagen sponge

水平	A(碳化二亚胺浓度)	B (交联时间)	C(交联温度)
1	10 mmol/L	6 h	20 ℃
2	30 mmol/L	12 h	25 ℃
3	50 mmol/L	24 h	30 ℃

时间及地点：于2012年10月至2014年6月在上海理工大学医疗器械与食品学院实验室完成。

材料：胶原蛋白(M_w≥30 u，纯度98%)由无锡市贝迪生物工程有限公司提供。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、L-羟脯氨酸等购于国药集团化学试剂有限公司。Ⅰ型胶原酶(125 U/mg)购于Sigma试剂有限公司。

实验方法：

胶原蛋白海绵碳化二亚胺交联工艺：将10 g/L的胶原蛋白溶液铺在平板中，冷冻干燥后得胶原蛋白海绵。将冻干的海绵浸入含有碳化二亚胺浓度为50 mmol/L，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为12.5 mmol/L(碳化二亚胺∶N-羟基琥珀酰亚胺=4∶1)的体积分数95%乙醇溶液中，调pH值至5.5，25 ℃下反应24 h。待反应完成后，用去离子水清洗样品数遍并二次冻干，即得胶原蛋白海绵。

单因素分析：

碳化二亚胺浓度：分别配制含碳化二亚胺浓度为5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 mmol/L的体积分数95%乙醇溶液，按上述方法交联胶原蛋白海绵，以孔径、孔隙率、吸水率、体外降解率为主要参考指标综合选定最适碳化二亚胺浓度。

交联时间：分别控制交联反应时间为2，4，6，8，12，16，20，24 h，按上述方法交联胶原蛋白海绵，以孔径、孔隙率、吸水率、体外降解率为主要参考指标综合选定最适交联时间。

交联温度：分别控制交联反应温度为5，10，15，20，25，30，35 ℃，按上述方法交联胶原蛋白海绵，以孔径、孔隙率、吸水率、体外降解率为主要参考指标综合选定最适交联温度。

正交实验优化：为了优化交联工艺，在单因素基础上选择碳化二亚胺浓度(A)、交联时间(B)、交联温度(C)为实验因子，以具有显著性差异的平均孔径大小、降解率为指标，采用L₉(3⁴)正交实验设计，见表1。

孔径、孔隙率测定：将材料在液氮中冷冻后再冻干，然后喷金后通过S-4800型扫描电子显微镜(日本，日立)观察海绵的微观结构和表面形貌，通过孔径软件统计海绵孔径大小。

称取一定量的海绵，记为m_s，浸入盛满乙醇质量为m₁的比重瓶中，使乙醇充分充盈于胶原海绵孔隙中。脱气，加满乙醇，再次称量，质量记为m₂，小心取出胶原海绵，称量剩余乙醇与比重瓶的质量，记为m₃，孔隙率按照如下公式计算^[26]：

孔隙率(%) =(m₂- m₃- m_s)/(m₁- m₃)×100%

吸水率测定：将完全干燥的胶原海绵样品(质量为W_d)浸泡于磷酸缓冲溶液(pH=7.4)中，24 h后用滤纸吸去表面水分直至无液体滴下，称质量为W_s。样品的吸水率按照如下公式进行计算：

W_A(%)=(W_s-W_d)/W_d×100%

体外降解率测定：称取一定质量(W₀)的胶原海绵，浸泡于胶原酶含量为200 U的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中， 37 ℃恒温培养箱中消化一定时间。在特定时间点取出样品，去离子水洗3次，真空冷冻干燥后称质量(W_t)，支架材料的体外降解率为：

D%=(W₀-W_t)/W×100%

主要观察指标：碳化二亚胺交联后胶原蛋白海绵的孔径、孔隙率、吸水率及体外降解率。

统计学分析：由第一作者采用SPSS 19.0统计软件对数据进行方差分析和t 检验。

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