局部应用神经生长因子对周围神经损伤后骨折早期愈合的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.15.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨折愈合机制复杂，受到多种因素的影响，骨折延迟愈合、不愈合时有发生，如何促进骨折愈合成为亟待解决的问题。
目的：观察周围神经损伤后局部应用神经生长因子对骨折早期愈合的影响。
方法：36只健康雄性Wistar大白鼠建立胫骨骨折模型，将其随机分为4组，每组18个肢体。①骨折+盐水组为胫骨骨折予以双侧腓肠肌生理盐水注射。②骨折伴神经损伤+盐水组胫骨骨折伴神经损伤予以生理盐水注射。③骨折+神经生长因子组为胫骨骨折予以局部注射神经生长因子。④骨折伴神经损伤+神经生长因子组为神经损伤、胫骨骨折予以局部注射神经生长因子。对各组骨痂计量学结果等情况进行观察对比。
结果与结论：①骨痂量：干预4周时与骨折+盐水组、骨折+神经生长因子组、骨折伴神经损伤+神经生长因子组比较，骨折伴神经损伤+盐水组骨痂量最多，其他3组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。②骨计量指标：干预2周时，骨折伴神经损伤+盐水组骨吸收表面积明显大于骨折伴神经损伤+神经生长因子组(P < 0.05)，骨折+盐水组破骨细胞指数明显大于骨折+神经生长因子组(P < 0.05)；干预4周时，矿化骨小梁宽度，骨折+盐水组明显小于骨折+神经生长因子组(P < 0.05)，骨折伴神经损伤+盐水组明显小于骨折伴神经损伤+神经生长因子组(P < 0.05)。结果提示周围神经损伤后的骨折局部应用神经生长因子均可增强成骨能力，且可有效抑制破骨细胞活动，促进骨折早期愈合。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 神经生长因子, 周围神经损伤, 骨折, 早期愈合

Abstract:

BACKGROUND: Fracture healing mechanism is complex and affected by many factors, and delayed fracture healing or nonunion often occurs. How to promote fracture healing has become a serious problem.
OBJECTIVE: To observe the effect of local application of nerve growth factor on early fracture healing after peripheral nerve injury.
METHODS: Thirty-six healthy male Wistar rats were selected to establish tibial fracture models, which were randomly divided into four groups, with 18 limbs in each group. Group A: tibial fracture+normal saline injection via bilateral gastrocnemius muscles; group B: tibial fracture+nerve injury+normal saline injection; group C: tibial fracture+local injection of nerve growth factor; group D: tibial fracture+nerve injury+local injection of nerve growth factor. Callus metrology results were compared among different groups.
RESULTS AND CONCLUSION: The callus volume was the most in the group B at 4 weeks of intervention, but there were no different among the other three groups (P > 0.05). At 2 weeks of intervention, the bone resorption area was significantly larger in the group B than the group D (P < 0.05), and the osteoclast index was significantly higher in the group A than the group C (P < 0.05); while at 4 weeks of intervention, the mineralized bone trabecular width was significantly lower in the group A than the group C (P < 0.05) as well as lower in the group C than the group D (P < 0.05). These findings indicate that after peripheral nerve injury, local application of nerve growth factor can enhance the osteogenic ability, effectively inhibit osteoclast activity, and promote the early healing of fracture.

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Key words: Nerve Growth Factor, Fractures, Bone, Fracture Healing

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 2

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引言

骨折是临床常见病和多发病，随着交通工具的不断普及，交通事故造成的骨折越来越常见，骨折类型和严重程度越来越复杂。骨折愈合机制非常复杂，涉及到生物力学、细胞生物学、内分泌学等多种学科^[1]。目前，研究主要集中在3个方面：一是分子生物学研究如成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血管内皮生长因子；二是物理学研究如超声波、电磁场等对骨折愈合的影响；三是组织工程的研究如人工材料替代治疗等^[2]。尽管目前骨折治疗研究取得了很大进展，但由于骨折愈合受到个体差异、骨折类型、骨折严重程度、治疗水平等多种因素影响，骨折延迟愈合和不愈合在临床上时有发生，延长患者住院时间，增加患者医疗费用，给患者及其家庭带来严重的精神压力和经济负担。如何促进骨折愈合，成为骨科医生亟需解决的问题。近年文献报道，骨折合并脑损伤的患者骨痂生长速度快、数量多，骨折愈合时间明显短于未合并有颅脑损伤的患者^[3-4]。因此，神经生长因子对骨折可能存在一定的影响。

神经生长因子属于生物活性复合蛋白，其具有促进细胞生长的作用，在调节中枢及外周神经元的生长及发育等过程中具有重要作用^[5]。近年来医学界开始广泛关注神经因素对于骨生长的影响，并已形成了“神经-内分泌-骨”的轴线调节理论，当周围神经损伤之后，有关内分泌因子的水平及活性将受到严重影响^[6]。基于上述骨调节理论，骨修复程序将难以有效实现，因此伴有神经损伤的骨折发生后，其骨愈合情况通常远不及单纯骨折。但有关内分泌因子是否就是神经生长因子，以及神经生长因子是如何影响骨折后骨愈合目前尚无定论。

为探讨可维持神经元存活及诱导交感神经纤维向靶组织生长的神经生长因子在伴有神经损伤的骨折愈合中的作用，实验采用了36只健康雄性Wistar大白鼠作为研究对象，并尝试制作了周围神经损伤合的骨缺损模型，对其采用局部应用神经生长因子对骨折早期愈合的修复效果进行了观察讨论，分析神经生长因子对骨折愈合促进作用，通过建立大白鼠骨折模型，为神经生长因子与骨折愈合的相关性提供实验基础，旨在为骨折治疗提供参考，为治疗骨折提供新的方法与思路。

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材料方法

设计：随机、双盲、对照动物实验。

时间及地点：实验于2013年12月至2014年2月在广元市中医院骨二科完成。

材料：选取健康雄性Wistar大白鼠36只，体质量为(219.5±20.3) g，大白鼠来源：中国医科大学实验动物中心繁殖饲养的3月龄封闭群大白鼠(以下简称大白鼠)，为一级(普通级)合格实验动物，许可证号：辽实条合字1号。将36只大鼠随机分为4组，每组18个肢体。

实验过程中全部按照《关于善待实验动物的指导性意见》的要求对动物进行处置^[3]。

注射用鼠神经生长因子：商品名丽康乐，30 μg/瓶，珠海市丽珠集团丽珠制药厂生产(批准文号：国药准字s20100005)。

实验方法：

建立胫骨骨折模型及神经损伤模型：大鼠建立胫骨骨折模型，并随机切断一侧坐骨神经。首先进行腹腔内注射麻醉，麻醉使用氯胺酮，使用剂量为100 mg/kg，麻醉之后取仰卧位，对双胫骨中点处周径进行测量，测量之后对术区进行消毒。于胫骨上段前侧部位，做楔形开槽，开槽的深度和宽度分别为3 mm和2 mm。建立神经损伤模型，取俯卧位，于大鼠的股外两侧腹股沟韧带水平部位，对股神经进行切除，切除长度为10 mm左右；对侧做切口暴露，注意不做对侧神经切除，采用相同的方法进行胫骨开槽。

术后对骨折+盐水组与骨折伴神经损伤+盐水组注射生理盐水，注射方式为肌注，注射部位为双侧腓肠肌，每肢体注射的剂量为每日0.1 mL。骨折+神经生长因子组与骨折伴神经损伤+神经生长因子组则注射神经生长因子，注射方法与部位同上，每肢体的注射剂量为每日0.1 mL，或者为每日0.2 U。

指标检测：使用X射线、CT进行测量，操作按照说明书进行。于干预2，4周分别于各组取9肢体，对各期骨痂量(X射线测量3次，取平均值)、胫骨标本骨计量学结果进行观察和对比。

主要观察指标：①各组各期骨痂量对比情况。②各组干预2周时胫骨标本骨计量学情况。

统计学分析：数据经SPSS 18.0统计学软件处理，数据以x(_)±s表示，计量资料经t 检验，数据对比以P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

神经生长因子属于多功能因子，在人体内主要分布于脑、神经节、心脏、脾等组织及成纤维细胞、骨骼肌、胶质细胞等。近年研究报道，神经生长因子在不同部位的骨组织中分布不同。张贵春等^[7]研究报道，伴有或不伴有神经损伤的骨折，局部注射神经生长因子都可抑制骨细胞活动，促进成骨能力增强，促进愈合。刘宇鹏等^[8]研究结果也显示，神经生长因子能促进骨折愈合过程中血管内皮细胞因子的生成，促进骨折愈合。刘振纲等^[9]通过实验发现神经生长因子对失神经状态下骨折断端的骨化有促进作用。骨折周围肌肉等软组织，均与骨折端血供具有密切相关性，其也可对骨折端代谢起到重要作用^[10-15]。正常情况下骨骼肌受神经系统的抑制性调节，在周围神经损伤后骨骼肌肉由于失去神经营养作用，进而导致无法维持肌细胞的正常形态结构，最终造成失用萎缩^[16-18]。肌细胞萎缩直接影响了骨折端血液供应，致使其正常代谢机制无法实现，从而进一步加重了骨折后骨损伤^[19-20]。

本组研究显示，在干预2，4周时，大鼠周围神经损伤侧的骨痂量有明显变化，骨折伴神经损伤+盐水组与其余各组相较其骨痂量明显更高。说明失去神经支配鼠胫骨骨折形成骨痂量较有神经支配的更大。与刘宇鹏等^[8]报道相符。刘宇鹏等指出无神经支配的但在形成骨痂的35 d之后，局部骨质的生物力学强度明显减低，与正常胫骨相较仅为正常者的1/5左右，具有神经支配组的胫骨骨痂相对较少，在35 d之后其生物力学强度明显高于无神经支配组，与正常胫骨相较可达到正常者1/2左右。另外，尽管骨折伴神经损伤+神经生长因子组大鼠亦切断了支配神经，但是其由于应用神经生长因子，其了形成的骨痂量也明显小于骨折伴神经损伤+盐水组大鼠，且与有神经支配的骨折+盐水组和骨折+神经生长因子组相仿。说明经局部应用神经生长因子之后，可使大鼠神经功能发生改变，经注射达到损伤部位均可获得一定治疗效果，其机制可能为神经生长因子于骨骼肌中存在表达，可促进运动神经元对神经营养物质合成且可促进骨骼肌钙泵活性恢复^[21-24]。

在干预4周时，骨折+神经生长因子组较骨折+盐水组的骨小梁宽度明显增宽，说明骨折+神经生长因子组最早完成骨构建，提示神经因子无论是骨源性或者是外源性均可促进骨重建，对于骨折患者引入外源性神经生长因子治疗可促使骨折愈合。进一步研究对周围神经损伤后的骨折伴神经损伤+神经生长因子组大鼠局部应用神经生长因子治疗之后的各项指标，发现骨折伴神经损伤+神经生长因子组的骨痂量、实质量与正常骨折者相较均无明显差异，同为神经损伤而骨折伴神经损伤+神经生长因子组与骨折伴神经损伤+盐水组相较前者抑制破骨细胞的作用更佳。说明伴神经损伤骨折后局部应用神经生长因子(骨折伴神经损伤+神经生长因子组)能够恢复“神经-内分泌-骨”的轴线调节路径^[25-29]，促进骨愈合，其效果明显优于未局部应用神经生长因子(骨折伴神经损伤+盐水组)。另一方面提示骨痂量并不能完全代表骨强度，骨折伴神经损伤+神经生长因子组与骨折伴神经损伤+盐水组相较骨折伴神经损伤+神经生长因子组骨痂量明显少，一定程度上亦说明周围神经损伤之后局部应用神经生长因子，可有效减少由于神经损伤后破骨细胞活性增强所导致的骨痂量增殖，神经生长因子不仅可使成骨能力增强，并且具有效抑制破骨细胞活动及促进骨痂成熟的作用^[30-35]。

本研究主要通过大鼠骨折模型进行实验，大鼠胫骨骨折愈合的生理过程与人体基本相似。但是由于大鼠胫骨比较细，骨折间隙一般较小，通常不超过1 mm，不利于动态观察骨折愈合过程中的组织学和影像学变化^[17]。研究结果推测，神经生长因子促进周围神经损伤骨折早期愈合可能是通过以下机制：①调节骨折愈合过程的炎症反应。②诱导神经纤维生长，增加骨折局部血流供应^[36-37]。③对影响骨折愈合的相关基因进行调节^[38-39]。根据本实验研究结果及相关文献报道，神经生长因子对人体骨折愈合可能有较好的治疗效果，为骨折不易愈合的部位如股骨颈、舟骨、胫骨中下段等骨折治疗提供了新的治疗方法和思路^[40]。由动物实验结果外推至人体仍需要进行大量实验论证，由于本研究的实验样本量比较少，因此实验结果仍需加大样本量研究。

综上所述，在周围神经损伤后局部应用神经生长因子可有效促进骨折愈合，具有重要意义。可能与正常骨组织与骨痂中存在神经生长因子与其受体的表达有关，需进一步深入研究。

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