胚胎干细胞尾静脉注射移植糖尿病肾病大鼠的氧化应激反应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.012

摘要/Abstract

摘要：

背景：近年来研究资料显示，糖尿病并发症的发生、发展与机体内氧化应激的平衡破坏程度有着密切的相关性。

目的：探讨胚胎干细胞对糖尿病肾病大鼠氧化应激反应的影响。

方法：原代培养小鼠胚胎干细胞，观察细胞形态，免疫组化检测表面抗原标志表达。腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素建立糖尿病肾病SD大鼠模型，细胞实验组经尾静脉注射胚胎干细胞，模型对照组注射等量PBS，正常对照组不造模，一次性腹腔注射柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液，共注射2次，末次注射细胞后5周，检测各组大鼠血糖、肾功能指标(尿蛋白/尿肌酐、血尿素氮和血肌酐)，测定肾组织氧化应激产物丙二醛及蛋白羰基含量，免疫印迹检测超氧化物歧化酶的表达水平。

结果与结论：胚胎干细胞为椭圆形或圆形，边界清晰，折光性好，高表达Oct-4、SSEA-1；与正常对照组比较，模型对照组和细胞实验组肾功生化指标、丙二醛、蛋白羰基含量均明显升高，超氧化物歧化酶表达量显著下降(P < 0.05)；与模型对照组比较，细胞实验组肾功生化指标、丙二醛、蛋白羰基含量明显下调，超氧化物歧化酶表达量明显回升(P < 0.05)。结果表明胚胎干细胞可以通过抑制氧化应激反应的进程从而逆转糖尿病肾病的发生发展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 胚胎干细胞, 糖尿病肾病, 氧化应激, 丙二醛, 蛋白羰基, 超氧化物歧化酶

Abstract:

BACKGROUND: Occurrence and development of diabetic complications is closely related to the severity of oxidative stress imbalance in the body.
OBJECTIVE: To investigate the effect of embryonic stem cells on oxidative stress response of rats with diabetic nephropathy．
METHODS: Primarily cultured rat embryonic stem cells were observed for cell morphology and surface antigen detection. Sprague-Dawley rats were divided into experimental group (two injections of embryonic stem cells via the tail vein), model group (injection of the same volume of PBS), and normal control group (with no modeling, intraperitoneal injection of sodium citrate-citrate buffer). In the former two groups, the rats were intraperitoneally injected sodium citrate-citrate buffer diluted streptozotocin to establish diabetic nephropathy models before treatment. At 5 weeks after the last injection, blood glucose level, renal function indicators (urine protein/urine creatinine, blood urea nitrogen and serum creatinine) were tested in each group; contents of malondialdehyde and protein carbonyl were detected in the kidney; the expression level of superoxide dismutase was detected by western blot assay.
RESULTS AND CONCLUSION: The embryonic stem cells were oval or round, with clear boundary and good refraction, and highly expressed Oct-4 and SSEA-1. Compared with the control group, renal biochemical indicators, malondialdehyde and protein carbonyl contents were significantly increased, while the expression level of superoxide dismutase was decreased dramatically in the model group and experimental group (P < 0.05); compared with the model group, the renal biochemical indicators, malondialdehyde and protein carbonyl contents were dropped significantly in the experimental group, but the expression of superoxide dismutase was significantly rebounded (P < 0.05). Taken together, embryonic stem cells can reverse the occurrence and development of diabetic nephropathy by inhibiting oxidative stress in progress.

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Key words: Embryonic Stem Cells, Diabetic Nephropathies, Oxidative Stress

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 2

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年6至9月在郑州大学干细胞研究中心完成。

材料：

实验动物：8周龄健康清洁级雌性SD大鼠35只，体质量200-250 g，由河南省实验动物中心提供，适应性喂养 2 d。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。

实验方法：

E14细胞培养：首先将适量1 g/L明胶溶液加入到 100 mm细胞培养皿中，轻轻振荡，使明胶溶液可以覆盖培养皿的细胞生长面，25 min后将明胶溶液吸出，干燥后使用。将5 mL E14细胞(细胞浓度为1.0×10¹⁰ L^-¹)接种于该培养皿中，细胞培养液为高糖DMEM(体积分数为20%胎牛血清+0.1 mmol/L β-巯基乙醇+0.1 mmol/L非必需氨基酸+ 1 mmol/L丙酮酸钠+2 mmol/L谷氨酰胺+1 000 U/mL白血病抑制因子)，于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度条件下培养。E14细胞传代及进行其他实验时先弃掉培养液，经PBS清洗后，向培养皿中加入胰蛋白酶/EDTA溶液进行消化，镜下观察，E14细胞从培养皿分离后，加入培养液终止消化，用吸管吹打细胞成单细胞悬液，按照1.0×10¹⁰ L^-¹细胞浓度接种到明胶处理的细胞培养皿内进行后续实验。

免疫荧光检测胚胎干细胞表面抗原：第5代E14细胞用0.01 mol/L PBS洗3次后，以45 g/L的多聚甲醛固定15 min，0.01 mol/L PBS洗涤，视情况用0.01 mol/L PBS+体积分数为0.2% Triton X 100室温穿透细胞20 min，再以即用型二抗宿主血清封闭25 min。弃血清后，加入一抗抗体Oct-4 (1︰200稀释)和SSEA-1(1︰50稀释)，并于4 ℃孵育过夜。PBS洗涤，再以Cy3标记二抗室温孵育1.5 h后，重复PBS洗涤，以1 mg/L Hoechst33344染细胞核，激光共聚焦显微镜及荧光显微镜下观察拍照。

糖尿病大鼠模型建立与分组：35只健康清洁级SD雌性大鼠，适应性喂养2 d，随机选取25只大鼠，在禁食12 h后，一次性腹腔注射以柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液稀释的链脲佐菌素55 mg/kg，剩余10只作为正常对照组以等量柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液腹腔注射。继续以普通饮食喂养10周，每周测血糖1次，并观察大鼠体征。若大鼠血糖持续≥16.7 mmol/L，尿蛋白>30 mg/24 h，则确定为糖尿病模型成功(5只失败)。20只造模成功模型糖尿病大鼠均表现为多饮、多食、多尿、消瘦等症状，将其成随机分为模型对照组(n=10)和细胞实验组(n=10)。

E14细胞移植：将E14细胞浓度调整为1.0×10¹⁰ L^-¹悬液，细胞实验组大鼠经尾静脉注射1 mL E14细胞悬液，模型对照组大鼠经尾静脉注射1 mL PBS，正常对照组不注射。首次细胞注射后10 d，进行第2次细胞注射。

血、尿生化指标检测：在末次注射细胞后5周，每组动物用ACCU-CHEKAetive230血糖仪检测血糖；用代谢笼收集每只大鼠的24 h尿液，-20 ℃保存待用。腹腔麻醉大鼠心穿刺抽血，血样和尿样用Au 2700型自动生化分析仪检测血尿素氮、血肌酐、尿肌酐及24 h尿蛋白量，计算尿蛋白/尿肌酐值。

氧化应激产物检测：在末次注射细胞后5周，每组动物各取3只，迅速取肾脏，置于液氮中，冻透后-70 ℃保存待测。①丙二醛含量采用脂质过氧化物测试盒检测，按说明书进行操作。②蛋白质羰基含量测定应用DNPH法检测：将冻存的肾组织匀浆，离心，BCA法测定蛋白浓度。与DNPH反应，沉淀蛋白质腙衍生物，离心，洗涤，羰基浓度用摩尔消光系数22.0/(mmol•cm)来计算。③免疫印迹检测MnSOD和CuZnSOD的表达：将冻存的肾组织剪碎(冰上操作)，SDS-PAGE变性凝胶电泳，转膜，封闭，兔抗大鼠MnSOD (1︰1 000)，CuZnSOD(1︰400)孵育，4 ℃过夜。IgG抗体-HRP多聚体37 ℃孵育3 h。以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示相对表达水平，进行定量分析。

主要观察指标：①免疫组化检测E14细胞表面抗原标志表达。②血糖、肾功能指标(尿蛋白/尿肌酐、血尿素氮和血肌酐)。③肾组织氧化应激产物丙二醛及蛋白羰基含量。④免疫印迹检测超氧化物歧化酶的表达水平。

统计学分析：所有数据用SPSS 13.0软件处理，计量资料以x(_)±s表示，组间比较采用重复测量资料方差分析，组间两两比较用LSD-t 法，а=0.05。

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讨论

糖尿病肾病是糖尿病常见的慢性微血管并发症^[10-12]，据WHO预计，2030年全球糖尿病患者将达3.7亿，其中1/3可能发展为糖尿病肾病，最近在Lancet上发表的1篇关于慢性肾脏病的流行病学研究显示中国慢性肾脏病的患病率为10.8%，而这部分人群中有36.4%患有糖尿病，分析显示糖尿病是慢性肾脏病的独立危险因素^[13]。同时，中国糖尿病肾病的发病率也呈逐年升高趋势，已成为糖尿病致死的主要原因之一。有研究认为，发生糖尿病时，肾组织内葡萄糖自动氧化^[14-15]，蛋白质非酶糖化以及代谢应激将导致氧化反应产物产生过多，破坏肾组织正常的氧化还原平衡，造成肾组织的氧化应激状态，此时，肾皮质脂质过氧化终产物丙二醛含量增高，而超氧化物歧化酶含量降低^[16]。过氧化应激在糖尿病肾病发病机制中起关键作用，因此寻找早期预防或延缓糖尿病肾病发生的治疗方法已引起人们的高度重视。

糖尿病肾病的治疗一直是临床较为棘手的医学难题，治疗思路主要集中在控制血糖、血压、血脂等危险因素以及抑制肾素-血管紧张素系统^[17-20]，但治疗效果并不理想。近年来，具有自我更新和多向分化潜能的干细胞是生命科学研究的热点。本实验利用胚胎干细胞移植治疗糖尿病肾病，通过观察氧化应激产物的改变来了解其改善糖尿病肾病症状的具体机制。

原代培养的胚胎干细胞，边界光滑清晰，折光性好，形状为椭圆形或圆形，高表达胚胎干细胞的标志Oct-4、SSEA-1。应用链脲佐菌素诱导建立糖尿病模型，出现持续高血糖状态并引起并发症的出现，10周后出现明显的糖尿病体征，生化指标也已达到糖尿病肾病标准^[21]。许多学者通过将体外培养的骨髓间充质干细胞移植入糖尿病肾病大鼠体内的方式观察到了骨髓间充质干细胞对糖尿病肾病的改善作用^[22-23]，如周虹等^[24]将骨髓间充质干细胞经体外扩增培养后移植入糖尿病肾病大鼠体内，结果显示标记后的骨髓间充质干细胞能趋化到肾脏，移植组24 h尿总蛋白降低，在移植第2周肾肥大指数较糖尿病肾病对照组减少。Ezquer等^[25]对链脲佐菌素所致1型糖尿病小鼠输注正常小鼠的骨髓间充质干细胞，结果显示骨髓间充质干细胞治疗组可有效缓解小鼠的高血糖和高尿糖，并且尿蛋白减少，糖尿病肾病的病理改变减轻。而本研究采用胚胎干细胞经尾静脉植入糖尿病肾病大鼠体内，检测生化指标显示大鼠的血糖水平明显减低，糖尿病肾病大鼠肾功能相关指标如血尿素氮和血肌酐等增高，说明肾脏出现严重损害，而胚胎干细胞移植后各项指标明显改善，表明胚胎干细胞可以减轻糖尿病肾病大鼠的肾脏功能损伤，促进其功能的改善，有明显的治疗作用。

Forbes等^[1]报道糖尿病肾病时肾组织脂质和蛋白质氧化反应增强。糖尿病大鼠血清抗超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶主要作用在于清除机体内超氧阴离子、脂质过氧化物及过氧化氢，从而阻断活性氧自由基进一步损伤机体，是机体内主要的活性氧自由基清除剂^[26-27]。Naruse等^[28]研究显示增加氧化应激和降低抗氧化效应可以使血糖控制恶化，从而促进糖尿病微血管病变的进展。高血糖通过多种途径与细胞内外的蛋白质和脂质等形成糖基化终末产物^[29-30]，氧化应激与糖基化终末产物的形成相互加强而形成恶性循环，促进糖尿病微血管病变的发生。而最近的研究表明限制钠盐摄入或者应用抗氧化剂治疗从而降低氧化应激反应^[31]，延缓糖尿病微血管病变的发展。本实验移植胚胎干细胞糖尿病肾病大鼠肾组织的脂质氧化产物丙二醛及蛋白质氧化产物羰基含量明显低于模型对照组，提示胚胎干细胞具有抑制脂质及蛋白质氧化作用，减轻肾应激损伤。应用免疫印迹检测CuZnSOD和MnSOD显示，糖尿病肾病时两者表达明显增加，与Yoh等^[32]报道的结果基本一致。胚胎干细胞移植组大鼠肾组织CuZnSOD和MnSOD表达水平明显下降，提示胚胎干细胞可能通过抑制自由基生成，恢复超氧化物歧化酶的活性，上调超氧化物歧化酶的表达水平。

总之，实验结果提示应用胚胎干细胞移植治疗糖尿病肾病大鼠，能降低其血糖水平，改善肾功能，抑制氧化应激水平，逆转糖尿病肾病发生发展。但是否为胚胎干细胞分泌细胞因子的特性，抑制糖尿病肾病的致病因素，从而产生肾保护作用，尚待证明。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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