脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤：不同方式的疗效对比

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.011

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前，来源于人脐带的间充质干细胞移植途径主要为局部移植，存在创伤大、出血多、并发症多等缺点，限制了其在临床上的广泛应用。

目的：探讨静脉移植人脐带间充质干细胞治疗脊髓损伤的可行性。

方法：80只Wistar大鼠成功制备脊髓打击模型，随机分为5组：空白对照组10只大鼠不进行任何移植；DMEM局部移植组15只、DMEM静脉移植组15只大鼠分别通过局部、静脉途径移植DMEM；细胞局部移植组20只、细胞静脉移植组20只大鼠分别通过局部、静脉途径移植人脐带间充质干细胞悬液。术后定期行BBB评分、组织学观察和免疫组化检测来评价脊髓修复情况。

结果与结论：移植后1 d-2周各组间BBB评分差距小，差异无显著性意义；移植后4-12周，细胞局部移植组、细胞静脉移植组BBB评分明显高于其他3组，差异有显著性意义；细胞局部移植组、细胞静脉移植组间差异无显著性意义(P > 0.05)。组织学观察显示，细胞局部移植组、细胞静脉移植组损伤局部形成的空洞及胶质瘢痕较其他3组都相对减少，而细胞静脉移植组和细胞局部移植组相近。以上结果表明静脉移植的人脐带间充质干细胞能迁移到脊髓损伤部位，对急性脊髓损伤产生修复作用，且效果与局部移植相似。该方式简单易行，避免二次损伤、感染等，为治疗脊髓损伤提供了一种新的细胞移植途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 静脉移植, 人脐带间充质干细胞, 局部移植, 脊髓损伤

Abstract:

BACKGROUND: Currently, human umbilical cord derived-mesenchymal stem cells are mainly for local transplantation, which has some shortcomings, such as large trauma, bleeding, complications, that limit its widespread application in clinical practice.

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of intravenous transplantation of human umbilical cord derived-mesenchymal stem cells for repair of spinal cord injury.

METHODS: Eighty Wistar rats with spinal cord hitting were divided into five groups: blank control group with no transplantation (n=10), DMEM local transplantation group (n=15), DMEM intravenous transplantation group (n=15), cell local transplantation group (n=20), cell intravenous transplantation group (n=20). The functional recovery of spinal cord injury was observed with Basso, Beattie and Bresnahan scores at regular time as well as hematoxylin-eosin staining and immunohistochemistry staining.

RESULTS AND CONCLUSION: During 1 day to 2 weeks after transplantation, there was no significant difference in the Basso, Beattie and Bresnahan scores between the five groups; within 4-12 weeks after transplantation, the Basso, Beattie and Bresnahan scores were significantly higher in the two cell transplantation groups than the other three groups, but there was no difference between these two cell transplantation groups (P > 0.05). Histological observation showed that the number of voids and glial scars was less in the cell local transplantation group and cell intravenous transplantation group compared with the other three groups, and there was also no difference between the two cell transplantation groups. These results indicate that the intravenous transplantation of human umbilical cord derived-mesenchymal stem cells is similar to the local transplantation in the repair of acute spinal cord injury, which is simple and avoids secondary injuries and various complications. It is recommended that this method provide a new approach for cell transplantation.

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Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Injections, Intravenous, Spinal Cord Injuries

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 3

2.1 人脐带间充质干细胞的培养和鉴定 倒置显微镜下观察组织块，于10 d左右见多数组织块周围长出大量新生细胞，形态多为长梭样、纺锤形，主要围绕组织块散在分布(图1)，12-15 d时可见以组织块为中心周围细胞明显增多，细胞形态细瘦，类似成纤维样细胞，大体呈漩涡状或放射状分布。

传代培养后的细胞形态上大体一致，第5代时镜下可见大小均一，形态规则的成纤维样细胞(图2)。第3代细胞经过流式鉴定表明CD44、CD29、CD90、CD54阳性表达，而CD31、CD45、CD34、HLA-DR阴性表达，与其他研究结果相同^[1-7]。

2.2 实验动物数量分析 实验过程中，空白对照组死亡0只，DMEM局部移植组死亡2只，DMEM静脉移植组死亡1只，细胞局部移植组死亡2只，细胞静脉移植组死亡1只，死亡后给予重新补充观察。

2.3 各组大鼠BBB评分 见表1，图3。术前所有大鼠双后肢肌力正常，即BBB评分均为21分，造模成功后均呈现双后肢全瘫，移植后第1天BBB评分为0分或1分，随后各组BBB评分呈现逐渐上升的趋势。移植后3周细胞局部移植组、细胞静脉移植组BBB评分分别为7.20±0.70，7.12± 0.81，明显高于空白对照组、DMEM局部移植组、DMEM静脉移植组，差异有显著性意义(P < 0.05)，而细胞局部移植组、细胞静脉移植组间差异无显著性意义(P > 0.05)，空白对照组、DMEM局部移植组、DMEM静脉移植组间差异无显著性意义(P > 0.05)。移植后1 d，1，2周各组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；移植后4，6，8，10，12周，细胞局部移植组、细胞静脉移植组与其他3组比较差异有显著性意义(P < 0.05)，细胞局部移植组、细胞静脉移植组间差异无显著性意义(P > 0.05)，空白对照组、DMEM局部移植组、DMEM静脉移植组间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 苏木精-伊红染色观察结果 第8周时苏木精-伊红染色可见空白对照组、DMEM局部移植组、DMEM静脉移植组损伤区域向内凹陷，损伤局部结构紊乱，瘢痕增生，局部形成空洞，细胞走行方向不一致。细胞静脉移植组和细胞局部移植组相近，两组形成的空洞及瘢痕较其他3组都相对减少(图4)。

2.5 免疫荧光染色和免疫组化染色结果 移植后4周时，细胞局部移植组和细胞静脉移植组在损伤局部可见BrdU阳性染色的人脐带间充质干细胞，未损伤的部位则未见到明显的阳性染色，阳性细胞数量自损伤部位向两端逐渐越少(图5)。移植后8周时人脐带间充质干细胞大部分集中在损伤的脊髓实质周围，12周时细胞局部移植组和细胞静脉移植组脊髓损伤局部仍然有BrdU阳性染色的人脐带间充质干细胞，但是局部存活的细胞数量比8周时有所减少。空白对照组、DMEM局部移植组和DMEM静脉移植组在8，12周都未见到任何阳性染色细胞。

细胞局部移植组和细胞静脉移植组标本在移植后第4周时可见空洞周围主要以纤维性星形胶质细胞为主，第8周时星形胶质细胞数量下降，第12周时脊髓损伤局部形成大量的胶质瘢痕，两组形成的胶质瘢痕面积较其他3组减少。细胞局部移植组、细胞静脉移植组无明显差异，空白对照组、DMEM局部移植组和DMEM静脉移植组之间无明显差异(图6)。

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引言

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2011年2月至2013年6月在泰安市中心医院完成。

材料：

实验动物：80只清洁级Wistar大鼠，体质量200-220 g，雌雄不限，来源于山东鲁抗医药股份有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(鲁)2008 0002。

实验方法：

人脐带间充质干细胞的分离、培养与传代：取足月顺产、健康的孕妇新鲜脐带，采用组织块培养法培养。首先剔除血管组织，将华通胶剪成1 mm×1 mm×1 mm组织块，接种在24孔培养板，37 ℃温箱放置1 h，添加DMEM培养液继续培养。12-15 d进行传代，每3 d传1代。

人脐带间充质干细胞的鉴定与标记：取第3代细胞用0.125%胰蛋白酶-EDTA消化，置离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，然后PBS洗涤离心2次，流式细胞仪检测细胞表面标志表达。继续培养到第5代，当细胞达到50%融合时加入终质量浓度为10 mg/L的BrdU，37 ℃，体积分数为5%CO₂孵育箱避光孵育72 h，消化配制成细胞悬液备用。

动物模型的制备与分组：80只清洁级Wistar大鼠，体质量200-220 g，应用改良的Allen法制备脊髓损伤打击模型^[1]。以T₁₀椎体棘突为中心，依次切开，暴露硬脊膜，应用自制打击器打击，大鼠出现一过性的后肢痉挛及尾巴摆动即造模成功。80只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组10只大鼠只造模，不做任何移植；DMEM局部移植组15只、DMEM静脉移植组15只大鼠分别通过局部、静脉移植与细胞等量体积的DMEM；细胞局部移植组20只、细胞静脉移植组20只大鼠分别通过局部和静脉途径移植人脐带间充质干细胞悬液(细胞浓度为1×10⁹ L^-¹)。

静脉移植：大鼠脊髓急性损伤打击模型造模成功后，无菌纱布填塞伤口，无菌覆盖。体积分数为75%乙醇棉球反复擦洗大鼠尾部后，以左手的拇指和食指夹住大鼠的尾部远端1/4，可见暗红色走行的尾静脉，右手持一次性头皮针以和尾静脉几乎平行的角度向头端方向缓慢刺入，回抽见暗红色血液吸出，缓慢注入细胞悬液 0.2 mL，再注入0.1 mL的生理盐水。注射完毕后，轻轻拔出针头, 压迫穿刺处止血。

局部移植：大鼠急性脊髓损伤打击模型造模成功后，明胶海绵压迫止血使视野清晰，在距离损伤中心1 mm处的头尾两端处和损伤的脊髓区域中心共3个点，将事先准备好的微量注射器偏离后正中血管0.5 mm进针1.5 mm，缓慢注入DMEM或人脐带间充质干细胞悬液2 μL(3个点共6 μL)。注射完毕后留针3 min，止血，依次缝合椎旁肌肉和皮肤。

实验动物的术后饲养和管理：各组大鼠分笼饲养，垫料1周换新1次，饲料及饮水量不限。饲养室的温度控制在20-26 ℃，相对湿度以50%为宜，3 d消毒1次。每天肌肉注射青霉素，连续5 d。术中大鼠失血较多时，术后可皮下注射生理盐水或葡萄糖液来补充血容量。大鼠出现尿潴留后，应该每天挤压膀胱排尿两三次，连续3 d直至大鼠膀胱功能恢复。

主要观察指标：

BBB评分：移植后1 d和1，2，3，4，6，8，10，12周进行BBB运动功能评分，评价大鼠后肢运动功能的恢复情况。每只大鼠观察时间为5 min。

组织学观察：各组移植后4，8，12周随机抽取2只大鼠，麻醉后用生理盐水和40 g/L中性多聚甲醛灌注。以损伤为中心取出长1.5 cm的脊髓标本，标记损伤中心及头尾端，40 g/L中性多聚甲醛固定24 h，常规脱水、石蜡包埋。行苏木精-伊红染色观察损伤区周围空洞形成情况；免疫荧光观察人脐带间充质干细胞在损伤局部存活、迁移、分化情况；免疫组化染色技术检测胶质纤维酸性蛋白表达，比较各组损伤局部胶质瘢痕形成面积。

统计学分析：应用SPSS 16.0数据库软件进行分析，各个时间点数据均以x(_)±s表示，组间的比较采用LSD法， P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

本实验利用组织块贴壁法培养，可以得到大量的细胞，经流式细胞仪鉴定为脐带间充质干细胞。通过病理切片显示，采用BrdU标记细胞对其以后的形态、传代、增殖不产生影响，并且生长传代的细胞可连续标记，有利于动态追踪间充质干细胞在体内的存活、生长和迁移。BrdU是胸腺嘧啶的衍生物，能够发挥代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)的作用，当细胞培养处于合成期时，将BrdU添加到培养液中，BrdU就会随着细胞的增殖移入到新生成的间充质干细胞的DNA中，而后利用小鼠抗BrdU单克隆抗体，结合荧光二抗或其他细胞标记物，进行双重染色，可判断增殖细胞的增殖速度，是细胞增殖的早期标志物，为研究细胞动力学有重要意义，也是标记移植细胞动态变化的常用标记方法^[8-10]。

干细胞具有自我更新和多向分化潜能，不仅它自身可以不断增殖传代，自我更新以维持足够的数目，而且又可以分化变为多种成熟的功能细胞^[11-14]，因此干细胞移植治疗脊髓损伤前景广阔。Weiss等^[15]将未经诱导的人脐带间充质干细胞移植到帕金森大鼠模型中，发现大鼠的肢体功能得到明显改善并且使受损的神经元得到了一定程度的恢复。而Ding等^[16]实验研究移植人脐带间充质干细胞治疗大脑中动脉栓塞模型，能够明显改善神经功能，所以人脐带间充质干细胞在神经修复方面显示出广阔的应用前景^[17-20]。

目前，细胞的移植途径主要有：①直接局部移植。②静脉移植。③蛛网膜下腔移植等。直接局部移植需要打开椎板，暴露脊髓，具有创伤大、出血多、不利于操作等缺点，患者难以接受这种方式，从而限制了其在临床上的广泛应用。蛛网膜下腔移植可能存在额外的风险，而静脉移植具有创伤轻微，操作简单并可以重复进行等优点，克服了局部移植的不足，也符合目前外科学微创发展的方向。

通过静脉途径等间接方式进行移植时，存在人脐带间充质干细胞向脊髓损伤部位定向迁移的问题。急性脊髓损伤后，导致血脊髓屏障固有结构破坏，损伤后脊髓缺血、缺氧，同时伴随着炎症细胞因子和血管活性物质的大量释放，使血脊髓屏障的通透性在一定短时间内显著增加，有助于间充质干细胞透过血脊髓屏障^[21]。Maikos等^[22]研究发现外伤性脊髓损伤后会出现血脊髓屏障的破坏，窗口期为7 d。

本实验应用人脐带间充质干细胞静脉移植治疗大鼠脊髓损伤，进行免疫组化检测、BBB后肢功能评分，结果提示移植人脐带间充质干细胞在损伤区可存活，明显改善动物肢体运动功能及神经传导功能，促进了脊髓损伤的恢复。结合国内外有关机制探讨的研究资料，推测人脐带间充质干细胞移植能够促进脊髓损伤恢复是通过以下几个方面发挥作用^[23-30]：①替代作用：间充质干细胞具有自我增生、多向分化潜能，能分化为神经元，替代受损的神经，重建神经结构。②营养作用：间充质干细胞可以分泌多种神经营养因子，例如，脑源性神经营养因子、神经生长因子等，这些因子调控神经递质，促进新生血管的形成，介导轴突再生，有利于脊髓损伤后大鼠的神经功能恢复。③诱导作用：在一定条件下能够诱导神经干细胞分化为神经元而进行修复，促进神经功能的改善。④桥接作用：间充质干细胞抑制胶质细胞生成，减少瘢痕形成，从而为轴突的再生创造条件，重建神经通路。⑤免疫作用：通过调节自身免疫过程，减轻免疫损伤，实现神经保护功能。

结论：实验研究表明静脉移植人脐带间充质干细胞能迁移到脊髓损伤部位，对急性脊髓损伤产生修复作用，且效果与局部移植相似。静脉移植治疗脊髓损伤简单易行，避免二次损伤、感染等，为人脐带间充质干细胞移植治疗脊髓损伤提供了一种新的移植途径，为临床应用提供了理论依据。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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