肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.009

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (14): 2179-2185.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.009

• 干细胞移植 stem cell transplantation • 上一篇下一篇

肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子的影响

姜艳杰¹，毛成刚²，宁险峰³，李荣⁴，李自普²

¹泰安市中心医院儿内科，山东省泰安市 271000；青岛大学附属医院，²儿内科，³心内科，⁴超声科，山东省青岛市 266003

修回日期:2015-03-06 出版日期:2015-04-02 发布日期:2015-04-02
通讯作者: 李自普，博士，教授，主任医师，青岛大学附属医院儿内科，山东省青岛市 266003
作者简介:姜艳杰，女，1987年生，山东省聊城市人，汉族，2014年青岛大学毕业，硕士，医师，主要从事小儿心血管疾病的研究。
基金资助:
青岛经济技术开发区重点科技发展计划项目(2012-2-63)

Human umbilical cord mesenchymal stem cells via intramuscular injection influence the expression of cytokines related to dilated cardiomyopathy in rats

Jiang Yan-jie¹, Mao Cheng-gang², Ning Xian-feng³, Li Rong⁴, Li Zi-pu²

¹Department of Pediatric Medicine, Taian Central Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China; ²Departmnet of Pediatric Medicine, ³Department of Cardiology, ⁴Department of Ultrasound, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Revised:2015-03-06 Online:2015-04-02 Published:2015-04-02
Contact: Li Zi-pu, M.D., Professor, Chief physician, Departmnet of Pediatric Medicine, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China
About author:Jiang Yan-jie, Master, Physician, Department of Pediatric Medicine, Taian Central Hospital, Taian 271000, Shandong Province, China
Supported by:
the Key Scientific Development Project of the Economic and Technological Development Zone of Qingdao, No. 2012-2-63

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有研究表明，在一定的剂量范围内，健康大鼠肌肉注射异种脐带间充质干细胞安全可靠，也证实了这一途径对扩张型心肌病大鼠心力衰竭同样安全有效。

目的：探讨肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子表达的影响。

方法：雄性SD大鼠160只，随机抽取20只作为正常组，余大鼠通过阿霉素腹腔注射方式建立扩张型心肌病模型。造模成功大鼠随机分为模型组、上清液祖、低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别经四肢肌肉注射人脐带间充质干细胞培养液、上清液及不同剂量的人脐带间充质干细胞，注射后观察大鼠一般情况，并于首次注射后4周再次给予相同剂量的培养液、上清液或脐带间充质干细胞。

结果与结论：ELISA检测结果显示，肌注前后模型组大鼠血清肝细胞生长因子、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激生物因子及血管内皮生长因子水平均较正常组增高(P < 0.05)，肌注后低剂量组肝细胞生长因子、白血病抑制因子、血管内皮生长因子和粒细胞集落刺激生物因子较肌注前显著升高(P < 0.05)，且较模型组明显升高(P < 0.05)，中剂量组白血病抑制因子较肌注前明显升高(P < 0.05)，高剂量组肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和粒细胞集落刺激生物因子较肌注前无明显差异(P > 0.05)。免疫组化及RT-PCR结果均显示，各肌肉注射组大鼠心肌细胞胰岛素样生长因子1、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子均较正常组表达增强，中剂量组呈强阳性表达，较其他各组增强明显。以上结果表明中、低剂量人脐带间充质干细胞肌肉注射可使扩张型心肌病大鼠血清肝细胞生长因子、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激生物因子及血管内皮生长因子水平增高，并增加心肌组织胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子表达。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 移植, 扩张型心肌病, 人脐带间充质干细胞, 肌肉注射, 血管内皮生长因子, 肝细胞生长因子, 胰岛素样生长因子1, 粒细胞集落刺激生物因子, 白血病抑制因子

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that intramuscular transplantation of xenogeneic umbilical cord mesenchymal stem cells in a certain dose range is safe and reliable, and it also confirm that this approach is

equally safe and effective for heart failure in rats with dilated cardiomyopathy.

OBJECTIVE: To explore the effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells through intramuscular injection on the cytokine expression in adriamycin-induced dilated cardiomyopathy (DCM) rats.

METHODS: Totally 160 rats were randomly divided into control group (n=20) and DCM group (n=140). Rats in the DCM group were administered adriamycin intraperitoneally to establish DCM model. The DCM rats were randomly subdivided into model control group (served as model group), cell supernatant group, the low-dose mesenchymal stem cell group (served as low-dose group), the middle-dose mesenchymal stem cell group (served as middle-dose group), and the high-dose mesenchymal stem cells group (served as high-dose group). Secondary injection was performed at 4 weeks after first injection.

RESULTS AND CONCLUSION: The ELISA test showed that the serum levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF), leukemia inhibitor factor (LIF) and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) were higher in the model group than the control group before and after intramuscular injection (P < 0.05). After intramuscular injection, the levels of HGF, LIF, GM-CSF and VEGF in the low-dose group were increased significantly (P < 0.05), which were significantly higher than those in the model group (P < 0.05). The level of LIF in the middle-dose group was significantly elevated after injection (P < 0.05), while there were no significant differences in HGF, VEGF and GM-CSF levels in the high-dose group before and after intramuscular injection (P > 0.05). Both the immunohistochemical and RT-PCR results showed that the expressions of insulin-like growth factor-1, VEGF and HGF were increased in all the DCM rats as compared with the control group, which were increased most in the middle-dose group. These findings indicate that low-dose and middle-dose human umbilical cord mesenchymal stem cells intramuscular injection can increase the serum levels of HGF, LIF, GM-CSF, VEGF and the expressions of IGF-1, HGF and VEGF in the myocardium of DCM rats.

全文链接：

Key words: Umbilical Cord, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Injections, Intramuscular, Cardiomyopathy, Dilated

中图分类号:

R394.2

姜艳杰，毛成刚，宁险峰，李荣，李自普. 肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2179-2185.

Jiang Yan-jie, Mao Cheng-gang, Ning Xian-feng, Li Rong, Li Zi-pu. Human umbilical cord mesenchymal stem cells via intramuscular injection influence the expression of cytokines related to dilated cardiomyopathy in rats [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2179-2185.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 参加实验动物数量160只，于建立扩张型心肌病模型阶段死亡60只，于2次肌肉注射观察阶段死亡16只。

2.2 人脐带间充质干细胞肌肉注射后各组大鼠血清HGF和LIF水平 肌注前，模型组、上清液组及不同剂量组间HGF和LIF水平差异无显著性意义(P > 0.05)，均较正常组明显升高(P < 0.05)；肌注后，模型组、上清液组及不同剂量组仍较正常组明显升高(P < 0.05)，其低剂量组不仅较肌注前显著升高(P < 0.05)，且较模型组和上清液组明显升高(P < 0.05)，同时中剂量组LIF水平亦较肌注前明显升高 (P < 0.05)，高剂量组HGF和LIF水平肌注前后无明显差异(P > 0.05)；3个剂量组间无明显的量效关系(P > 0.05)，见表2。

2.3 人脐带间充质干细胞肌注后各组大鼠血清GM-CSF和VEGF水平 肌注前，模型组、上清液组及不同剂量组间GM-CSF和VEGF差异无显著性意义(P > 0.05)，均较正常组明显升高(P < 0.05)；肌注后，模型组、上清液组及不同剂量组仍较正常组高(P < 0.05)，同时低剂量组GM-CSF和VEGF水平均较肌注前明显升高(P < 0.05)，中、高剂量组GM-CSF和VEGF水平肌注前后均无明显差异(P > 0.05)；3个剂量组间无明显量效关系(P > 0.05)，见表3。

2.4 人脐带间充质干细胞肌注后大鼠心肌IGF-1、VEGF、HGF表达情况 大鼠心肌IGF-1、HGF和VEGF的表达部位主要在细胞胞浆内，高倍镜下胞浆内有棕黄色小颗粒即为阳性。正常组和模型组大鼠心肌胞浆内可见少量棕黄色小颗粒，IGF-1、HGF和VEGF表达均呈弱阳性；上清液组及不同剂量组大鼠心肌细胞胞浆可见多量棕黄色颗粒，IGF-1、HGF和VEGF表达明显增多，其中低剂量组、中剂量组呈强阳性表达，见图1-3。
2.5 人脐带间充质干细胞肌注后各组大鼠心肌IGF-1、HGF、VEGF mRNA表达结果模型组、上清液组及不同剂量组HGF、VEGF和IGF-1 mRNA表达均较正常组明显增加(P < 0.05)；与模型组比较，上清液组IGF-1、HGF和VEGF mRNA的表达无变化(P > 0.05)，低剂量组HGF和VEGF mRNA的表达、中剂量组VEGF和IGF-1 mRNA的表达明显升高(P < 0.05)，但高剂量组HGF、VEGF和IGF-1 mRNA表达无变化(P > 0.05)。与低剂量组比较，中剂量组HGF和IGF-1 mRNA表达明显升高(P < 0.05)，高剂量组HGF和VEGF mRNA明显下降(P < 0.05)；与中剂量组比较，高剂量组HGF、VEGF和IGF-1 mRNA表达均明显下降(P < 0.05)，见表4。

参考文献

[1] Garg R, Yusuf S. Overview of randomized trials of angiotensin-converting enzyme inhibitors on mortality and morbidity in patients with heart failure. Collaborative Group on ACE Inhibitor Trials. JAMA. 1995;273(18):1450-1456.
[2] Pitt B, Poole-Wilson PA, Segal R, et al. Effect of losartan compared with captopril on mortality in patients with symptomatic heart failure: randomised trial--the Losartan Heart Failure Survival Study ELITE II. Lancet. 2000; 355 (9215):1582-1587.
[3] Solomon SD, Wang D, Finn P, et al. Effect of candesartan on cause-specific mortality in heart failure patients: the Candesartan in Heart failure Assessment of Reduction in Mortality and morbidity (CHARM) program. Circulation. 2004; 110(15):2180-2183.
[4] Poole-Wilson PA, Swedberg K, Cleland JG, et al. Comparison of carvedilol and metoprolol on clinical outcomes in patients with chronic heart failure in the Carvedilol Or Metoprolol European Trial (COMET): randomised controlled trial. Lancet. 2003;362(9377):7-13.
[5] Dandel M, Weng Y, Siniawski H, et al. Long-term results in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy after weaning from left ventricular assist devices.Circulation. 2005;112 (9 Suppl): I37-45.
[6] Sun CK, Chang LT, Sheu JJ, et al. Bone marrow-derived mononuclear cell therapy alleviates left ventricular remodeling and improves heart function in rat-dilated cardiomyopathy. Crit Care Med. 2009;37(4):1197-1205.
[7] 何红燕,林晓波,应文娟,等.人脐带间充质干细胞经体内定植并向心肌样细胞分化的研究[J].中国输血杂志,2009,22(3):188-191.
[8] 林晓波,何红燕,罗敏杰,等.人脐带间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究[J].实用儿科临床杂志,2007, 22(13):971-973.
[9] Noiseux N, Gnecchi M, Lopez-Ilasaca M, et al. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol Ther. 2006;14(6):840-850.
[10] 杨德忠,王伟,王薇,等.旁分泌机制在脂肪间充质干细胞移植治疗心肌梗死中的作用[J].第三军医大学学报,2013,35(9):874-879.
[11] Huang J, Zhang Z, Guo J, et al. Genetic modification of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability, migration, engraftment, and capillary density in the injured myocardium. Circ Res. 2010;106(11):1753-1762.
[12] 张文祥,王思平,锡洪敏,等.Wistar 大鼠肌肉注射异种脐带间充质干细胞的安全性[J].中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6620-6627.
[13] 王思平,聂娜娜,王丽,等.肌肉注射异种脐带间充质干细胞大鼠心肌肌钙蛋白 I 及血清相关因子的表达[J].中国组织工程研究, 2014, 18(10): 1566-1572.
[14] 王琪,张文祥,王思平,等. 肌肉注射人脐带间充质干细胞健康大鼠心肌组织ki-67, phh3及cTnT 的表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(41): 6671-6677.
[15] 王本臻. 肌肉注射人脐带间充质干细胞对阿霉素诱导扩张型心肌病大鼠心功能及心肌超微结构的影响[D]. 青岛:青岛大学, 2014.
[16] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408.
[17] Gnecchi M, Danieli P, Cervio E. Mesenchymal stem cell therapy for heart disease. Vascul Pharmacol. 2012;57(1):48-55.
[18] van den Akker F, Deddens JC, Doevendans PA, et al. Cardiac stem cell therapy to modulate inflammation upon myocardial infarction. Biochim Biophys Acta. 2013;1830(2):2449-2458.
[19] Mohammadi Gorji S, Karimpor Malekshah AA, Hashemi-Soteh MB, et al. Effect of mesenchymal stem cells on Doxorubicin-induced fibrosis. Cell J. 2012;14(2):142-151.
[20] Karahuseyinoglu S, Cinar O, Kilic E, et al. Biology of stem cells in human umbilical cord stroma: in situ and in vitro surveys. Stem Cells. 2007;25(2):319-331.
[21] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001;98(18):10344-10349.
[22] Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, et al. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 2002;105(1):93-98.
[23] Gnecchi M, He H, Noiseux N, et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 2006;20(6):661-669.
[24] Tang YL, Zhao Q, Qin X, et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 2005;80(1):229-236.
[25] Tögel F, Hu Z, Weiss K, et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am J Physiol Renal Physiol. 2005;289(1):F31-42.
[26] Breitbach M, Bostani T, Roell W, et al. Potential risks of bone marrow cell transplantation into infarcted hearts. Blood. 2007; 110(4):1362-1369.
[27] Vulliet PR, Greeley M, Halloran SM, et al. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 2004;363(9411):783-784.
[28] Widimsky P, Penicka M. Complications after intracoronary stem cell transplantation in idiopathic dilated cardiomyopathy. Int J Cardiol. 2006;111(1):178-179.
[29] Yoon YS, Park JS, Tkebuchava T, et al. Unexpected severe calcification after transplantation of bone marrow cells in acute myocardial infarction. Circulation. 2004;109(25): 3154-3157.
[30] Barbash IM, Chouraqui P, Baron J, et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 2003;108(7):863-868.
[31] Menasché P, Hagège AA, Vilquin JT, et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol. 2003;41(7): 1078-1083.
[32] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001;410(6829): 701-705.
[33] Lin H, Shabbir A, Molnar M, et al. Adenoviral expression of vascular endothelial growth factor splice variants differentially regulate bone marrow-derived mesenchymal stem cells .J Cell Physiol. 2008;216(2):458-468.
[34] Vacanti V, Kong E, Suzuki G, et al. Phenotypic changes of adult porcine mesenchymal stem cells induced by prolonged passaging in culture. J Cell Physiol. 2005;205(2):194-201.
[35] Yoon YS, Wecker A, Heyd L, et al. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction. J Clin Invest. 2005; 115(2):326-338.
[36] Nagaya N, Kangawa K, Itoh T, et al. Transplantation of mesenchymal stem cells improves cardiac function in a rat model of dilated cardiomyopathy.Circulation. 2005 ;112(8): 1128-1135.

引言

扩张型心肌病是一种原因未明的原发性心肌疾病，其特征为左心室或右心室或双侧心室扩大，并伴有心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭。尽管包括ACEI、ARB、β-受体阻滞剂等在内的传统药物治疗对改善左室功能、充血性心力衰竭及长期预后等方面有效^[1-5]，但长期预后仍不乐观，死亡率居高不下，因而迫切需要一个安全且更有效的改善心室功能及长期预后的治疗方式。间充质干细胞具有多向分化潜能，不同的诱导环境下可分化为不同组织细胞(心肌细胞、成骨细胞、软骨细胞及神经细胞等)，可作为理想的种子细胞，用于身体各组织器官的修复治疗。各国学者也将间充质干细胞作为治疗扩张型心肌病的新型治疗手段进行了广泛的研究^[6]。有研究证实脐带间充质干细胞经诱导可以分化为心肌样细胞^[7-8]，而越来越多的研究表明，间充质干细胞移植治疗心血管疾病的机制主要为旁分泌作用^[9-11]。目前心血管疾病的干细胞移植途径多为冠状动脉和心内膜注射、心外膜注射及静脉注射，而肌肉注射移植途径目前国内研究较少。课题组前期研究证实，在一定的剂量范围内，健康大鼠肌肉注射异种脐带间充质干细胞安全可靠^[12-14]，也证实了这一途径对扩张型心肌病大鼠心力衰竭同样安全有效^[15]。本实验以扩张型心肌病大鼠为研究对象，多次肌肉注射不同浓度人脐带间充质干细胞，检测肌肉注射后血清中相关因子及心肌组织中血管内皮生长因子(vasuclar endothelial growth factor，VEGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、白血病抑制因子(leukaemia inhibitor factor，LIF)、粒细胞集落刺激生物因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)等表达变化，探讨异种移植人脐带间充质干细胞治疗大鼠扩张型心肌病的相关机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年9月至2014年3月在青岛大学附属医院SPF级动物实验室和中心实验室完成。

材料：

实验动物：16周龄清洁级雄性SD大鼠160只，体质量(180±20) g，由山东鲁抗医药有限公司提供，批号：SCXK[鲁]20130001。所有大鼠均以同等条件饲养于青岛大学医学院附属医院动物房，饲养环境符合SPF级标准。

细胞：人脐带间充质干细胞及其培养上清液、DMEM培养液均由青岛大学医学院附属医院干细胞中心提供，产妇及其家属签署知情同意书。人脐带间充质干细胞均经过流式细胞仪检测及微生物检测，细胞表型符合间充质干细胞的表型特征：CD105(+)、CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、HLA-DR(-)。

实验方法：

动物分组、造模：160只SD大鼠饲养1周后随机分为正常组20只，给予腹腔注射生理盐水，每次2 mL，每周1次，连续8周；扩张型心肌病组140只，给予腹腔注射阿霉素，每次剂量为2 mg/kg，每周1次，连续8周。以达到下述标准为建模成功：大鼠心脏几何形态学参数变化显著，主要表现为左心室扩大(平均左心室舒张期内径和左心室收缩期内径均较对照组显著增大)，同时室壁动度减弱，心室壁变薄，部分大鼠出现心包积液，射血功能受损。

脐带间充质干细胞治疗：在大鼠最后1次腹腔注射结束后2周开始脐带间充质干细胞的肌肉注射治疗。正常组肌肉注射PBS，每次2 mL，存活的扩张型心肌病组大鼠随机分为模型对照组16只(简称模型组，肌肉注射DMEM培养液，每次2 mL)、脐带间充质干细胞上清液组16只(简称上清液组，肌肉注射人脐带间充质干细胞培养上清液，每次2 mL)、脐带间充质干细胞低、中、高剂量组各16只(简称低剂量组、中剂量组、高剂量组，分别肌肉注射人脐带间充质干细胞悬液，每次2 mL，含0.25×10⁶，1.0×10⁶，4.0×10⁶个细胞)。肌肉注射部位为大鼠四肢骨骼肌，前肢每侧注射0.3 mL，后肢每侧取两点，每点注射0.35 mL；肌肉注射后观察大鼠一般情况，并于首次注射2周后进行第2次等量注射。

取材：每组大鼠于首次肌注前和第2次肌注后2周测定心功能，同时经内眦取血用于测定血清GM-CSF、HGF、LIF和VEGF水平，离心后置于-70 ℃冰箱备用；第2次肌注后2周处死大鼠，即刻开胸取出心脏，切除心房及右心室，快速切下心尖部心肌组织，切取少量置于液氮中备用，余置于体积分数为10%甲醛溶液中固定，制作心肌组织蜡块备用。

大鼠血清GM-CSF，HGF，LIF和VEGF水平测定：采用双抗夹心ELISA法测定，严格根据试剂盒要求进行检测。①实验前1 h，从冰箱中取出所需血清标本及试剂盒，平衡至室温。②配制标准品液：VEGF、HGF、LIF、GM-CSF标准品使用前每管中分别加入蒸馏水400，200，200，200 μL，溶解后分别加入标准孔内。③待测孔加100 μL血清标本。④将孔板置于37 ℃恒温箱120 min，洗板。⑤每孔加一抗工作液50 μL，混匀。⑦将孔板置于37 ℃恒温箱反应60 min，洗板。⑧加酶标抗体工作液，每孔100 μL。⑨将孔板置于 37 ℃恒温箱，VEGF反应60 min，HGF、LIF、GM-CSF各反应30 min。洗板。⑩显色：每孔各加底物液100 μL，置于37 ℃恒温箱，反应5-10 min后终止。用酶标检测仪检测各孔吸光度值。根据标准孔浓度及吸光度值绘制标准曲线，将各样本吸光度值带入标准曲线后计算出相应样本浓度。

大鼠心肌IGF-1、HGF、VEGF表达：免疫组化法检测IGF-1、HGF、VEGF表达：①石蜡切片脱蜡。②体积分数为3%H₂O₂去离子水孵育10 min，阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗，5min×3次。滴加一抗，IGF-1(1︰100稀释)，HGF(1︰100稀释)，VEGF(1︰150稀释)，37 ℃孵育1 h。PBS冲洗，5 min×3次。③滴加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗。④DAB染色。⑤自来水充分冲洗，复染，封固。结果判定：IGF-1、HGF、VEGF 3个细胞因子均为心肌细胞胞浆中出现棕黄色颗粒状物为阳性。

RT-PCR法检测心肌组织IGF-1、HGF、VEGF mRNA表达：从液氮中取出心肌组织，按试剂盒说明提取心肌组织RNA，在Microtube管中配制PCR反应体系(SYBR Premix EX TAq^TM Ⅱ10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，DNA模板2.0 μL，dH₂O 6.4 μL)，在Light Cycler PCR仪上进行Real Time PCR反应。在RT-PCR反应的指数期，设定荧光信号阈值，该阈值是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，Ct(Cycle threshold)值为每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，将Ct值作为样本表达量标准，每个标本重复3次，Ct值取平均值^[16]。结果用2^-^??Ct法表示，即各标本目的基因相对模型组标本的相对表达量。引物序列见表1。

主要观察指标：各组大鼠血清中GM-CSF，HGF，LIF和VEGF水平，各组大鼠心肌组织中IGF-1、HGF、VEGF的表达情况。

统计学分析：数据以x(_)±s表示，应用SPSS 17.0统计软件行统计学分析，两组数据间比较采用独立样本t 检验，多组定量资料采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t 检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

目前的研究表明，间充质干细胞移植对扩张型心肌病有明确的治疗作用^[17]，但其发挥治疗作用的机制尚存在争议^[18-20]。当前的大量临床前实验证实，间充质干细胞可分化为新生心肌细胞，这种再生的心肌细胞具有收缩性，可与宿主细胞形成偶联，参与心肌同步收缩，使心肌顺应性改善，从而发挥正常心脏功能^[21-22]。心肌细胞的这种再生机制被认为是干细胞发挥治疗作用的主要机制。然而近年来，越来越多研究显示，移植的干细胞主要通过释放细胞因子、抗凋亡因子、生长因子等旁分泌作用，促进心肌内源性修复而达到改善心功能的作用^[23-25]。

目前的干细胞移植实验多通过经冠状动脉或心肌内注射途径实施，这些方式均为有创性，可能导致有害瘢痕组织形成、心律失常、钙化及心脏微梗死灶等^[26-29]，因而临床实用性差。而经静脉注射途径则被认为存在肺部首过效应而使归巢到心脏的细胞数量明显减少^[30]。目前国内通过肌肉注射途径移植干细胞治疗心血管疾病的相关报道较少，由于肌肉注射途径与静脉注射途径机制相似，故也存在肺部首过效应，即归巢到受损心肌的细胞数量较少，而本课题组的前期研究已证明这一移植方式亦能提高左室功能^[15]，促进心肌再生，抑制细胞凋亡及心室重构。作者尝试通过研究肌肉注射前后相关细胞因子表达，探讨肌肉注射移植治疗扩张型心肌途径的治疗机制。

研究发现，成肌细胞移植入心脏后并未与宿主细胞形成电生理融合^[31]，移植后的间充质干细胞通过分化再生发挥治疗作用并非是移植后治疗作用的主要机制^[32]，而间充质干细胞在体内外可分泌多种血管生长因子，这些因子可通过旁分泌机制促进新生血管生成^[11]，增加组织血供以促进心肌的修复。Tang等^[24]把自体间充质干细胞及其培养液分别注射入大鼠心肌梗死部位，2周后测定间充质干细胞组大鼠血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、基质细胞衍生因子1α的表达较模型组大鼠增加，且前者心肌毛细血管密度明显提高，凋亡心肌细胞减少，左室收缩功能明显改善。本研究结果显示，各肌肉注射组大鼠均较正常组大鼠血清VEGF水平增高。同时，免疫组化法定性检测及RT-PCR结果均显示各肌肉注射组大鼠心肌表达VEGF水平较正常组增高，而中低剂量组大鼠心肌VEGF表达水平明显高于其他各组。这些结果可能提示心肌受损时自身VEGF水平反应性增高以维持自身心功能，而接受人脐带间充质干细胞注射后可进一步提高心肌VEGF水平以修复受损心肌。高剂量人脐带间充质干细胞移植组大鼠不能使心肌VEGF表达水平提高，则可能提示人脐带间充质干细胞注射剂量过高无益于提高心肌VEGF表达而增强心功能。

另有研究证实，间充质干细胞可分泌LIF、GM-CSF、SDF-1、HGF和VEGF等多种细胞因子^[33-34]，这些细胞因子能够动员骨髓干祖细胞，迁移的干祖细胞可以进入心肌，参与内源性心肌损伤修复机制。在本研究中，各扩张型心肌病模型组均较正常组大鼠血清HGF水平增高，而人脐带间充质干细胞低剂量组较其他各组增高水平明显，且差异均有显著性意义，这可能提示心肌受损后血清HGF水平反应性升高，而一定剂量的人脐带间充质干细胞移植后可进一步提高HGF这一心肌保护因子的血清水平。免疫组化法定性及RT-PCR定量检测心肌HGF表达与血清VEGF的表达趋势一致，各扩张型心肌病模型组大鼠心肌表达HGF水平较正常组增高，而低剂量组大鼠心肌HGF表达水平明显高于其他各组，这也说明人脐带间充质干细胞经肌肉注射对促进HGF这一心肌保护因子的表达具有剂量依赖性。

在本研究中，免疫组化法检测心肌IGF-1表达水平结果显示，各扩张型心肌病模型组均较正常组表达水平增加，而中剂量组则显示出表达水平较其他各组明显增加。另外，RT-PCR结果亦表明，不同剂量组及模型组均较正常组大鼠IGF-1基因表达上调，中剂量组较模型组、上清液组IGF-1表达水平增加，表明心肌受损时和人脐带间充质干细胞移植均能提高心肌IGF-1的表达水平，这与前期研究认为IGF-1是心肌的保护因子的结果一致^[35-36]，中剂量组较模型组、上清液组IGF-1基因表达水平增加而低剂量组和高剂量组则未显著增加，说明人脐带间充质干细胞移植使受损心肌IGF-1这种心肌保护因子表达上调具有剂量依赖性。同时，各扩张型心肌病模型组均较正常组大鼠血清LIF水平增加，而低剂量组较其他各组血清LIF水平均高，差异均有显著性意义，这提示心肌损伤和人脐带间充质干细胞移植均能使大鼠血清LIF水平增高，而低剂量的人脐带间充质干细胞移植更能提高血清LIF水平。

Orlic等^[21]应用SCF、GM-CSF动员骨髓间充质干细胞，促使其归巢入心肌梗死区域，复制或分化为心肌细胞，结果发现心肌梗死面积缩小40%、心室腔扩大程度降低26%，左室舒张末压降低70%，射血分数及血流动力学均得到显著改善。本实验结果显示各扩张型心肌病模型组均较正常组大鼠血清GM-CSF水平增高，低剂量组和上清液组均较模型组大鼠血清GM-CSF水平增高，这一结果提示人脐带间充质干细胞在体内外均能够分泌GM-CSF，而经肌肉注射人脐带间充质干细胞促进血清GM-CSF水平的提高有剂量依赖性。

综上所述，经肌肉注射一定剂量人脐带间充质干细胞可使扩张型心肌病大鼠血清肝细胞生长因子、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激生物因子及血管内皮生长因子水平增高，并能增加心肌组织胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子表达。

肌肉注射脐带间充质干细胞对扩张型心肌病大鼠相关细胞因子的影响

Human umbilical cord mesenchymal stem cells via intramuscular injection influence the expression of cytokines related to dilated cardiomyopathy in rats

PDF

可视化

被引次数

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	林清凡, 解一新, 陈婉清, 叶振忠, 陈幼芳. 人胎盘源间充质干细胞条件培养液可上调缺氧状态下BeWo细胞活力和紧密连接因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 4970-4975.
[2]	蒲锐, 陈子扬, 袁凌燕. 不同细胞来源外泌体保护心脏的特点与效应[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(在线): 1-.
[3]	张秀梅, 翟运开, 赵杰, 赵萌. 类器官模型国内外数据库近10年文献研究热点分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(8): 1249-1255.
[4]	王正东, 黄娜, 陈婧娴, 郑作兵, 胡鑫宇, 李梅, 苏晓, 苏学森, 颜南. 丁酸钠抑制氟中毒可诱导小胶质细胞活化及炎症因子表达增多[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1075-1080.
[5]	汪显耀, 关亚琳, 刘忠山. 提高间充质干细胞治疗难愈性创面的策略[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1081-1087.
[6]	万然, 史旭, 刘京松, 王岩松. 间充质干细胞分泌组治疗脊髓损伤的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1088-1095.
[7]	廖成成, 安家兴, 谭张雪, 王倩, 刘建国. 口腔鳞状细胞癌干细胞的治疗靶点及应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1096-1103.
[8]	谢文佳, 夏天娇, 周卿云, 刘羽佳, 顾小萍. 小胶质细胞介导神经元损伤在神经退行性疾病中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1109-1115.
[9]	李珊珊, 郭笑霄, 尤冉, 杨秀芬, 赵露, 陈曦, 王艳玲. 感光细胞替代治疗视网膜变性疾病[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1116-1121.
[10]	焦慧, 张一宁, 宋雨晴, 林宇, 王秀丽. 乳腺癌类器官研究进展及临床应用前景[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1122-1128.
[11]	王诗琦, 张金生. 中医药调控缺血缺氧微环境对骨髓间充质干细胞增殖、分化及衰老的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1129-1134.
[12]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[13]	孔德胜, 何晶晶, 冯宝峰, 郭瑞云, Asiamah Ernest Amponsah, 吕飞, 张舒涵, 张晓琳, 马隽, 崔慧先. 间充质干细胞修复大动物模型脊髓损伤疗效评价的Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1142-1148.
[14]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[15]	史洋洋, 秦英飞, 吴福玲, 何潇, 张雪静. 胎盘间充质干细胞预处理预防小鼠毛细支气管炎[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 991-995.