肺癌干细胞富集及相关标志物的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：肺癌干细胞与肺癌的治疗和预后等紧密相关，通过对其表面标志物和致瘤性的研究，可以为临床诊治提供更多的参考依据。

目的：探讨肺癌球体干细胞的富集方法及其致瘤性。

方法：使用含有表皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1以及碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基对肺癌细胞进行诱导，采用免疫荧光检测诱导后细胞相关标志物的表达。小鼠皮下移植诱导后肺球体细胞，以了解其致瘤性。

结果与结论：经无血清悬浮培养和诱导，肺癌细胞形成细胞球体，免疫荧光检测显示80%以上的球体细胞呈SP-C、CCSP以及OCT4染色阳性。小鼠皮下移植球体细胞后可形成肿瘤。结果表明，无血清悬浮培养肺癌细胞可增殖形成细胞球体，该细胞球体中肺癌干细胞高度富集并具有致瘤性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺癌, 细胞生长因子, 球体, 标志物

Abstract:

BACKGROUND: Lung cancer stem cells are tightly related to the treatment and prognosis of lung cancer. We can provide more references for clinical diagnosis and treatment of lung cancer through the study on the tumorigenicity and surface markers of lung cancer stem cells.

OBJECTIVE: To explore the enrichment methods for lung cancer stem cells and cellular tumorigenicity.

METHODS: Lung cancer stem cells were induced in serum-free culture medium containing epidermal growth factor, insulin-like growth factor 1, and basic fibroblast growth factor. Then, the expressions of related surface markers were detected using immunofluorescence method. After that, mice were implanted subcutaneous with lung cancer stem cell spheres to understand the tumorigenicity of lung cancer stem cells.

RESULTS AND CONCLUSION: Lung cancer stem cells under serum-free induction and culture were changed to sphere-forming cells, and the immunofluorescence detection showed that over 80% of sphere-forming cells were positive for CCSP, SP-C and OCT4. After transplantation of sphere-forming cells, the mice showed a high tumorigenicity. These findings indicate that sphere-forming cells are formed after serum-free suspension culture of lung cancer stem cells, which have a higher tumorigenicity.

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Key words: Lung Neoplasms, Neoplastic Stem Cells, Culture Media, Serum-Free, Insulin-Like Growth Factor I, Epidermal Growth Factor, Fibroblast Growth Factor 2

中图分类号:

R394.2

陈平，王键. 肺癌干细胞富集及相关标志物的表达[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2167-2171.

Chen Ping, Wang Jian.

Enrichment of lung cancer stem cells and expression of related markers

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2167-2171.

图/表（结果） 1

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引言

材料方法

设计：细胞水平体外实验。

时间及地点：实验于2014年5月在中国医科大学完成。

材料：

细胞株：肺癌细胞株由中国医科大学提供，将细胞置于DMEM培养液(含体积分数为10%胎牛血清)中进行传代培养，得到活跃增殖期细胞备用。

实验动物：4周龄NOD-SCID免疫缺陷小鼠10只，体质量(80±15) g，由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供。所有小鼠毛色均匀，反应良好，性情温和，无脱毛、断尾现象。

实验方法：

球体培养和分离：将活跃增殖期肺癌细胞置于无血清DF12培养液中，调整细胞浓度为2×10⁷ L^-¹，取5 mL细胞培养于超低吸附培养皿中，分别加入20 μg/L不同的细胞生长因子，包括重组人成纤维细胞生长因子10、重组人表皮细胞生长因子以及重组人胰岛素样生长因子1，每隔2 d，添加1次上述3种因子，至球体形成为止。收集细胞，离心(100×g)后留取球体细胞沉淀备用，对球体细胞进行免疫荧光检测和RT-PCR分析。

免疫荧光检测：细胞浓度调整至1×10⁹ L^-¹，取200 μL滴于盖玻片培养过夜，用40 g/L多聚甲醛进行固定，利用非离子型表面活性剂0.1%TritonX-100增加细胞膜通透性，然后进行染色；一抗为SP-C特异性抗兔多克隆IgG、CCSP特异性抗羊多克隆IgG和OCT4特异性抗羊多克隆IgG，稀释浓度均为1∶50，置于4 ℃湿盒中反应过夜，经PBS淋洗去除非结合的抗体，然后用异硫氰酸荧光素标记的驴抗羊多克隆IgG于室温中反应2 h，再次PBS淋洗，DAPI染核，封固，置于荧光显微镜下进行观察。

RT-PCR检测：收集细胞，利用Trizol试剂提取总RNA，取5 μg RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电脉30 min后，溴化乙锭染色摄片。

动物实验：上述球体细胞收集后调整细胞浓度为1× 10⁸ L^-¹，于NOD-SCID免疫缺陷小鼠皮下注射100 μL。每周1次观察肿瘤的生长情况，待肿瘤直径≥ 1 cm之后，麻醉小鼠，在活体荧光成像仪下摄片，然后摘取皮下肿瘤。

主要观察指标：①球体形成情况。②球体细胞标志物表达情况。③球体细胞致瘤性。

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讨论

临床治疗各种恶性肿瘤的方法针对的大多是肿瘤组织中的绝大多数细胞^[6]。肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中的具有干细胞性质的细胞群体，有逃逸免疫和侵袭转移等特性^[7]。肿瘤干细胞占肿瘤细胞的0.01%-1%，具有无限自我更新潜能、高增殖、耐药，是肿瘤组织形成、复发和转移的根源^[8-9]。

常规治疗方法只能对部分肿瘤细胞产生不同程度的杀伤，对肿瘤干细胞却没有影响^[10]。一些恶性肿瘤患者在接受常规治疗之后，即便获得一定的临床效果，肿瘤组织出现一定的消退^[11-12]。但经过一段时间治疗之后，未被杀伤的肿瘤干细胞便会发挥作用，导致肿瘤的再次形成，即临床常见的恶性肿瘤转移或者复发等^[13-14]。肺癌是一种对人体危害较大的恶性肿瘤，患者临床大多会表现出刺激性咳嗽、胸痛等症状，严重影响到患者的工作和生活，为延长患者的生存时间，提高患者的存活率，临床对早中期肺癌患者进行治疗的时候，可以采用化疗和放疗的方式^[15]。但是，经过长期大量的临床治疗可以发现，肺癌患者在经过一定的治疗之后，仍然会出现较高的转移率和复发率。究其原因，便是患者体内的肺癌干细胞在发挥作用^[16-18]。肿瘤干细胞具有一定的特殊性，可以有效躲避人体免疫系统，并通过一定的“伪装”，对人体免疫系统中的一些细胞产生影响，诱导其发生转化，为自身生长提供一定的环境条件^[19]。一旦肿瘤干细胞发挥效应，人体的免疫系统便会受到极大的影响，各种恶性肿瘤便会开始快速生长，引发患者病情的急剧恶化。因此，常规的手术切除和化疗、放疗等方式无法从根本实现肿瘤的治愈^[20-23]。通过临床治疗，即使99.99%的肿瘤细胞被杀死，但只要有0.01%的肿瘤干细胞存在，仍会造成复发和转移，临床上90%癌症患者死于复发转移^[24-25]。

当前肺癌干细胞研究的焦点是分离和鉴定肺癌干细胞，一般采用流式细胞仪分选可能的肺癌细胞亚群，再进行生物学鉴定，以证明其干细胞特性。但由于缺乏特异性的干细胞筛选的分子标志，筛选结果争议较大。肿瘤干细胞标志物是一些在肿瘤干细胞中特异性高表达(阳性表达)、不表达或低表达(阴性表达)的分子^[26]。国外一些学者通过研究报道^[27]，CD133(+)/nestin(+)可能为肺癌干细胞的标记物。研究过程中，可以按照肿瘤干细胞具有能在无血清悬浮培养条件下富集的特性，采用添加生长因子的无血清培养基对肺癌细胞进行悬浮培养，获得肺癌细胞球体，然后对分离到的肺癌细胞球体进行生物学功能鉴定。

目前，在实际的动物细胞培养过程中，血清是最为常用和基本的添加物。无血清培养基则可以在不添加血清的条件下即为细胞的体外生长和繁殖提供良好的条件^[28-30]。从原代肿瘤中获取肿瘤细胞，在含有适当生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子等)的无血清培养基中培养，非肿瘤干细胞由于“血清饥饿”，将无法正常存活，但肿瘤干细胞却可以存活并繁殖^[31-32]，由此肿瘤细胞将得到纯化并维持干细胞状态，其得率也将提高。一些学者还利用此种方式对乳腺癌细胞进行培养^[33]，以得到稳定的乳腺癌干细胞或者祖细胞群，更好的进行各项研究。无血清培养具有实用、简单、快捷等诸多优点，可以快速获得研究所需的足够数量细胞^[34-36]。

为获得球体细胞，培养过程中可以利用不同的细胞生长因子进行诱导^[37]。目前可使用的细胞生长因子有多种不同的类型，包括重组人成纤维细胞生长因子10和重组人表皮细胞生长因子以及重组人胰岛素样生长因子1等^[38]。通过加入各种生长因子，可以有效对细胞生长产生刺激作用，促进球体的形成。Dontu等^[39-40]利用含表皮细胞生长因子和B27生长因子的无血清培养基对正常乳腺干细胞及乳腺癌干细胞进行诱导，即得到相应的球体细胞。本研究中，尝试利用表皮细胞生长因子和胰岛素样生长因子1及碱性成纤维细胞生长因子联合使用的方式对SPC-A1细胞群进行诱导，得到相应的肺癌干细胞球体，经免疫荧光检测可得80%以上的球体细胞呈SP-C、CCSP及OCT4染色阳性，经小鼠移植实验表明球体细胞具有高致瘤性。对于重组人成纤维细胞生长因子10诱导肺癌干细胞形成球体的具体机制，目前尚无明确的定论，分析可能与重组人成纤维细胞生长因子10可以维持肺癌干细胞的增殖和自我更新能力等因素有关。

综上所述，无血清悬浮培养肺癌细胞可以实现肺癌干细胞的富集，相应的标志物会出现表达，且肺癌干细胞具有高致瘤性，为临床肺癌的治疗提供一定的参考依据。本研究受到研究时间等因素的限制，仅选择肺癌干细胞进行研究。关于其他类型肿瘤干细胞相关问题，还需要在今后的研究中予以进一步分析。总之，通过对各种肿瘤干细胞的分析研究，可以更好的掌握其分子机制，从而为临床靶向治疗等提供可靠的参考依据。

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