乳腺癌干细胞培养鉴定及分化过程中微环境的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：乳腺癌干细胞会对乳腺癌的发生、转移等产生较大的影响。通过模拟肿瘤微环境，可以更好的对乳腺癌干细胞增殖与分化情况进行分析。

目的：探讨肿瘤微环境对乳腺癌干细胞分化过程的影响。

方法：对乳腺癌细胞及MCF-7细胞进行成纤维细胞上清液和无血清培养液PCM-2原代培养，观察乳腺癌细胞微球体的形成情况，采用MTT比色法检测乳腺癌细胞增殖能力，利用免疫细胞化学方法和RT-PCR方法检测乳腺癌干细胞标记物和上皮间质标记物的表达情况。

结果与结论：无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体直径显著大于成纤维细胞上清液。成纤维细胞上清液培养速度显著快于无血清培养液PCM-2。无血清培养液PCM-2培养第3天原代细胞中ALDH1表达率显著高于成纤维细胞上清液。与无血清培养液PCM-2培养比较，成纤维细胞上清液培养原代细胞中的ALDH1表达出现下调现象，而E-cadherin、Vimentin等上皮间质标记物表达则出现上调现象。在成纤维细胞上清液培养MCF-7细胞中的E-cadherin、VimenTin表达上调，而ALDH1、Oct-4等乳腺癌干细胞标记物表达下调。结果表明肿瘤微环境会对乳腺癌干细胞生存状态和分化过程产生一定的影响，成纤维细胞上清液中分泌的一些因子可以从一定程度上对乳腺癌干细胞样微球体的增殖与分化产生促进作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 乳腺癌, 乳腺癌干细胞, 肿瘤微环境, 微球体, 培养

Abstract:

BACKGROUND: Breast cancer stem cells have a greater impact on the occurrence and metastasis of breast cancer. Under simulated tumor microenvironment, we can better analyze the proliferation and differentiation of breast cancer stem cells.

OBJECTIVE: To explore the tumor microenvironment effect on the differentiation of breast cancer stem cells.

METHODS: Breast cancer cells and MCF-7 cells were primarily cultured in fibroblast supernatant and serum-free PCM-2 medium, and formation of breast cancer cells microspheres was observed. Proliferative ability of breast cancer cells was detected using MTT colorimetry, and the surface markers of breast cancer stem cells and epithelial-mesenchymal transition markers were measured using immunocytochemistry and RT-PCR methods.

RESULTS AND CONCLUSION: The diameter of primary cell microspheres was larger in the serum-free PCM-2 medium than in the fibroblast supernatant, but the culture speed was faster in the fibroblast supernatant than the serum-free PCM-2 medium. At 3 days of primary culture, the expression of ALDH1 in primary cells was greatly higher in the serum-free PCM-2 medium than in the fibroblast supernatant. However, the expressions of E-cadherin and vimentin were up-regulated in the fibroblast supernatant than in the serum-free PCM-2 medium. In addition, the expressions of E-cadherin and vimentin in MCF-7 cells cultured in the fibroblast supernatant were up-regulated, while the expressions of ALDH1 and Oct-4 were downregulated. These findings indicate that the tumor environment has some certain effects on the growth and differentiation of breast cancer stem cells, and some cytokines secreted from fibroblast supernatant can promote the proliferation and differentiation of breast cancer stem cell microspheres to some extent.

全文链接：

Key words: Breast Neoplasms, Tumor Microenvironment, Microspheres

中图分类号:

R394.2

张书卿，张博，洪亮，周永安，赵亮. 乳腺癌干细胞培养鉴定及分化过程中微环境的影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2155-2160.

Zhang Shu-qing, Zhang Bo, Hong Liang, Zhou Yong-an, Zhao Liang. Identification and differentiation of breast cancer stem cells under tumor microenvironment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2155-2160.

图/表（结果） 2

2.1 微球体形成状况 于倒置相差显微镜下，对2种培养液培养的细胞生长状况进行观察。其中，成纤维细胞上清液培养的原代细胞发生逐渐伸展情况，并伸展为长梭形，胞质丰富。无血清培养液PCM-2培养的原代细胞在培养3-5 d形成微球体，且随着培养时间的不断推移，微球体直径呈现出越来越大的情况，但数目则逐渐减少；无血清培养液PCM-2培养的原代细胞微球体直径大于成纤维细胞上清液，见图1。

2.2 MTT比色法检测细胞生长增殖情况 利用MTT比色法对2种培养液培养的原代细胞及MCF-7细胞生长情况进行测定，发现二者均处于持续生长状态。成纤维细胞上清液培养速度显著快于无血清培养液PCM-2培养速度。

2.3 免疫细胞化学检测乳腺癌干细胞标记物及上皮间质标记物表达情况 经免疫细胞化学检测，在原代细胞的ALDH1表达率方面，无血清培养液PCM-2培养第1天较高于第3，5天。其中，无血清培养液PCM-2和成纤维细胞上清液培养第3天原代细胞中ALDH1表达率分别为(46.40±5.58)%和(19.03±1.36)%，推测成纤维细胞上清液中成纤维细胞分泌的一些生长因子或趋化因子促进了乳腺癌干细胞样微球体的增殖与分化，见图2，3。

2.4 RT-PCR检测结果 成纤维细胞上清液与无血清培养液PCM-2培养进行比较，前者原代细胞中的ALDH1表达出现下调现象，而E-cadherin、Vimentin等上皮间质标记物则出现表达上调现象，见图4。在成纤维细胞上清液培养的MCF-7细胞中，E-cadherin、Vimentin出现表达上调现象，而ALDH1、Oct-4等乳腺癌干细胞标记物均出现表达下调现象，见图5。

参考文献

[1] 任远,李泽桂.基于乳腺癌干细胞的临床治疗进展[J].中国组织工程研究与临床康复,2011,15(6):1103-1106.
[2] 侯国芳,张瑾.乳腺癌干细胞研究进展[J].中华乳腺病杂志:电子版, 2012,6(4):441-446.
[3] 燕丽.5Fu对乳腺癌细胞向肿瘤干细胞样细胞逆向分化的作用[D]. 郑州:郑州大学,2011.
[4] 郑国沛.旁分泌或自分泌细胞因子在乳腺癌上皮—间质转化(EMT)及耐药和转移中的作用[D].长沙:中南大学,2013.
[5] 李静,欧周罗,邵志敏,等.微环境中间质细胞通过趋化因子对乳腺癌生长和转移的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2008,15(5): 494-496,500.
[6] 王欣荣.乳腺癌干细胞研究现状[J].国际肿瘤学杂志,2009, 36(11): 846-850.
[7] Lengerke C, Fehm T, Kurth R, et al. Expression of the embryonic stem cell marker SOX2 in early-stage breast carcinoma.BMC Cancer. 2011;11:42.
[8] Debeb BG, Xu W, Mok H,et al. Differential radiosensitizing effect of valproic acid in differentiation versus self-renewal promoting culture conditions.Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2010;76(3):889-895.
[9] Ricardo S, Vieira AF, Gerhard R, et al. Breast cancer stem cell markers CD44, CD24 and ALDH1: expression distribution within intrinsic molecular subtype.J Clin Pathol. 2011;64(11): 937-946.
[10] Xing F, Saidou J, Watabe K.Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment.Front Biosci (Landmark Ed). 2010;15:166-179.
[11] 尚文博,范忠林,马力.乳腺癌干细胞研究现状[J].临床肿瘤学杂志,2007,12(8):628-630.
[12] 刘为军,王昆华,龚昆梅,等.乳腺癌研究及治疗新靶点-乳腺癌干细胞的研究进展[J].中国癌症杂志,2010,20(1):66-69.
[13] Polyak K, Kalluri R.The role of the microenvironment in mammary gland development and cancer.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010;2(11):a003244.
[14] Korkaya H, Liu S, Wicha MS.Breast cancer stem cells, cytokine networks, and the tumor microenvironment.J Clin Invest. 2011;121(10):3804-3809.
[15] 林叔陈,张凤春,张雁云,等.乳腺癌干细胞的研究进展[J].肿瘤, 2008,28(8):719-722.
[16] Sneddon JB, Zhen HH, Montgomery K,et al.Bone morphogenetic protein antagonist gremlin 1 is widely expressed by cancer-associated stromal cells and can promote tumor cell proliferation.Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103(40):14842-14847.
[17] 屈洪波,韩明利,范原铭,等.阻断PI3K/Akt信号通路对低氧微环境中BCSCs微球体细胞增殖的影响[J].肿瘤,2013,33(1):36-41.
[18] Römer AM, Lühr I, Klein A,et al.Normal mammary fibroblasts induce reversion of the malignant phenotype in human primary breast cancer.Anticancer Res. 2013;33(4):1525- 1536.
[19] 王荣,羊晓勤,吕青.乳腺癌组织CD44+CD24-/LowESA+Lin-干细胞比例及影响因素分析[J].四川大学学报:医学版,2014,45(1): 53-56.
[20] 许立生,王水,黄中晶,等. CD44+/CD24-/low/ABCG2-乳腺癌干细胞与临床治疗及预后的关系[J].实用医学杂志,2011,27(21): 3877-3879.
[21] 王岫,吴捷,彭旭佳,等.乳腺癌组织中干细胞CD44+/CD24-表型与预后的关系[J].中外医疗,2014,33(6):57-59.
[22] Al-Hajj M, Wicha MS, Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.Proc Natl Acad Sci U S A. 2003;100(7):3983-3988.
[23] 王洪海,李连宏,毛俊,等.乳腺癌中干细胞标志物ALDH1及VHL/HIF-1α的表达及意义[J].临床与实验病理学杂志,2013, 29(6):598-602.
[24] 朱玉芬,任美敬,谷峰,等.肿瘤微环境对乳腺癌干细胞样微球体培养鉴定的影响[J].中国肿瘤临床,2014,41(22):1417-1421.
[25] Orimo A, Gupta PB, Sgroi DC,et al.Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 2005;121(3):335-348.
[26] 李治.乳腺癌干细胞的分离与鉴定及其自我更新和耐药机制的研究[D].武汉:华中科技大学,2006.
[27] 屈洪波,范原铭,韩明利,等.沉默HIF-2α表达对低氧下乳腺癌干细胞微球体富集的影响[J].中国肿瘤临床,2013,40(2):67-71.
[28] 付钰洁,常徽,糜漫天.乳腺癌干细胞的研究进展[J].重庆理工大学学报(自然科学版),2011,25(1):23-28.
[29] 张远起.乳腺癌干细胞的研究进展[J].广东医学院学报,2011, 29(6): 675-677.
[30] 张凤春,林叔陈,宋彩丽,等.乳腺癌干细胞的研究进展[C].哈尔滨:第十届全国临床肿瘤学大会暨2007年CSCO学术年会,2007: 106-113.
[31] 曹峰琦,陈翀,刘妍,等. 肿瘤pH微环境通过激活β-catenin/ TCF4增强人乳腺癌肿瘤细胞的干性[J].基础医学与临床,2014, 34(5): 622-627.
[32] 徐琦璘,王椋,赵春华,等.人脂肪来源间充质干细胞诱导人乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化[J].基础医学与临床,2012,32(6):623- 627.
[33] Ginestier C, Hur MH, Charafe-Jauffret E,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell Stem Cell. 2007; 1(5):555-567.
[34] 谢国柱.通过对肿瘤细胞致瘤潜能及上皮—间充质转化的研究探讨肿瘤干细胞假说的本质[D].广州:南方医科大学,2012.
[35] 陈颖欣,李连宏,孙杰,等.人乳腺病变组织乳腺癌耐药蛋白及细胞角蛋白8和嗜铬蛋白A的表达:可能与多向分化潜能干细胞相关[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(1):57-62.
[36] 赵阳.人脂肪干细胞与乳腺癌MCF-7、BT474细胞旁分泌机制影响的体外实验研究[D]. 广州:南方医科大学,2013.
[37] 何亚琴.人乳腺肿瘤干细胞的分离培养鉴定及低氧对乳腺肿瘤干细胞特性影响的研究[D]. 银川:宁夏医科大学,2013.
[38] 赵志正.复方苦参注射液干预BMSCs与乳腺癌细胞交互作用机理的体外实验研究[D].北京:中国中医科学院,2012.
[39] 宣恒华.干细胞微环境对小鼠卵母细胞体外成熟、胚胎发育的影响及其生物活性因子分析[D].合肥:安徽医科大学,2012.
[40] 康健豪,杨光,赵世光.肿瘤干细胞与肿瘤微环境的相互作用[J].临床神经外科杂志,2013,10(6):380-382.
[41] 王椋. 乳腺癌肿瘤环境中的间充质干细胞通过调节TGF-β1促进乳腺癌细胞的转移[D]. 北京:北京协和医学院(中国医学科学院),2011.
[42] 刘珊,张巍,刘夏,等.雄激素受体阳性乳腺癌干细胞的富集及其特性鉴定[J].中华实验外科杂志,2014,31(1):67-69.
[43] 陈刚,谢丽,刘宝瑞,等.以肿瘤干细胞为靶点的肿瘤治疗新策略[J].中华肿瘤杂志,2008,30(11):801-803.
[44] 张凤春,南飞飞,徐海燕,等.原代乳腺癌干细胞富集及其与临床病理特征的相关性分析[J].肿瘤,2012,32(9):724-730.

引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：2014年11至12月在湖北理工学院附属医院完成。

材料：

于无菌条件下微创获取1例原发性乳腺癌患者乳腺组织，女性，经临床病理诊断确诊为乳腺浸润性导管癌，未接受化疗和放疗。患者及其家属均知悉研究相关具体情况，签署知情同意书。

实验方法：

乳腺癌细胞培养：于清洁条件下，获取3-5 g乳腺癌组织标本，利用含抗生素的生理盐水进行冲洗，并去除脂肪组织，置于经HBSS清洗过的培养皿中，将处理过的标本剪碎，移入50 mL离心管，添加HBSS至40 mL后进行离心。离心结束弃去上清液，加18 mL HBSS、2 mL消化酶，于37 ℃条件下振荡消化1-3 h。消化结束后加DMEM/F12予以终止消化，追加30 mL HBSS。吹打后利用308 μm滤网进行过滤，离心，离心结束弃去上清液，加入含体积分数为10%小牛血清的培养液，置于体积分数为5%CO₂、37 ℃培养箱中进行培养。两三天更换1次培养液，待细胞密度接近90%时以无血清培养液PCM-2和成纤维细胞上清液进行悬浮培养。

MTT比色法检测乳腺癌细胞增殖能力：取对数生长期细胞进行消化和离心，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-¹，接种于96孔培养板中，另设空白对照孔。培养12 h细胞贴壁，继续培养24，48，72，96，120 h之后，每孔加入MTT(5 g/L) 20 μL，并设置3个复孔。继续培养，4 h后吸出培养液，加入二甲基亚砜200 μL，充分振荡 10 min。利用TECAN酶联检测仪对各孔吸光度值进行检测，检测波长为570 nm，参比波长为630 nm。

免疫细胞化学检测乳腺癌干细胞标记物ALDH1表达情况：对经过无血清培养液PCM-2和成纤维细胞上清液培养的原代细胞予以细胞爬片，将对数生长期细胞接种在4孔板的盖玻片上。待细胞均匀覆盖之后，弃去培养液，PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛室温固定30 min。固定结束再次用PBS冲洗并自然风干，体积分数为0.3%过氧化氢甲醇溶液孵育30 min(阻断内源性过氧化酶)，正常血清封闭30 min，封闭结束吸弃。滴加一抗，置于4 ℃条件下过夜，阴性对照以PBS代替一抗。分别在细胞贴壁第1，3，5天，利用三步免疫组织化学方法检测ALDH1的染色情况。

RT-PCR检测：采用Trizol法提取RNA并进行纯度鉴定，然后用RT试剂盒将RNA反转录成cDNA，最后进行PCR扩增，反应体系20 μL。内参基因为GAPDH基因。反应条件为：95 ℃条件下进行15 min的预变性——95 ℃条件下进行15 s的变性——56 ℃条件下进行30 s的退火处理——68 ℃条件下进行30 s的延伸，每个反应各设置2个复孔，一共进行40个循环。采用2^-^??Ct法计算各基因mRNA表达水平。RT-PCR相关引物序列见表1。

主要观察指标：①倒置相差显微镜下观察微球体形成情况。②细胞生长增殖情况。③乳腺癌干细胞标记物及上皮间质标记物表达情况。

统计学分析：利用SPSS 17.0软件进行统计学处理，组间比较予以t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

全文链接：

讨论

乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，对人体的危害极大^[10]。临床可以通过各种方式对乳腺癌患者进行治疗，一定程度上对肿瘤细胞的生长予以抑制^[11]。但很多患者仍会出现肿瘤细胞侵袭及转移现象，不利于提高治疗效果^[12-13]。分析出现侵袭与转移的原因，可能与乳腺癌中存在具有干细胞特性的乳腺癌干细胞有关^[14-17]。

国内外有学者通过研究发现了具有干细胞特性的CD44⁺CD24^-^/low细胞，并证实了乳腺癌干细胞的存在^[18-21]。还有一些学者报道，较之CD44⁺CD24^-^/low，仅需少量ALDH1阳性细胞，即可导致存在免疫缺陷小鼠体内肿瘤的形成^[22-23]。Sox-2、Oct-4是十分重要的转录因子，可以对胚胎干细胞的自我更新和多能性予以有效的维持，且这些因子的表达与实体瘤的不良预后之间呈正相关关系^[24-28]。本次研究结果显示，在原代细胞的ALDH1表达率方面，无血清培养液PCM-2培养在第1天较高于第3天和第5天。其中，无血清培养液PCM-2和成纤维细胞上清液培养第3天原代细胞中ALDH1表达率分别为(46.40±5.58)%和(19.03±1.36)%。分析出现这样情况的原因，可能是因为成纤维细胞上清液中的成纤维细胞可以分泌一定的趋化因子或者生长因子，从而对乳腺癌干细胞样微球体的增殖和分化产生一定的促进作用。经过悬浮培养，一些乳腺癌细胞会形成漂浮克隆小球，即为乳腺微球体^[29-30]。在进行三维立体培养的时候，这些球体会表现出一定的多向分化和自我更新能力。分析出现这一现象的原因，与乳腺微球体中可能含有干细胞成分有关^[31-34]。本研究中，利用两种不同的培养液对原代细胞予以培养。其中，成纤维细胞上清液中包含的各种成纤维细胞可以分泌多种因子和蛋白，从而对细胞外基质的生成产生促进作用^[35-36]，并可以产生基质金属蛋白酶，对细胞外基质予以调节，进而通过影响各种信号通路达到影响肿瘤细胞生长的效果^[37-40]。

在倒置相差显微镜下对两种培养液培养的细胞生长状况进行观察，无血清培养液PCM-2培养的原代细胞在培养3-5 d时形成微球体，且随着培养时间的不断推移，微球体直径呈现出越来越大的情况。对两种培养液培养的原代细胞微球体直径进行比较，无血清培养液PCM-2显著大于成纤维细胞上清液。

经RT-PCR 检测乳腺癌干细胞标记物及上皮间质标记物表达情况，与无血清培养液PCM-2进行比较，成纤维细胞上清液培养原代细胞中的ALDH1表达出现下调现象，而E-cadherin、Vimentin等上皮间质标记物则出现表达上调现象。在成纤维细胞上清液培养的MCF-7细胞中，E-cadherin、VimenTin出现表达上调，而ALDH1、Oct-4等乳腺癌干细胞标记物均出现表达下调现象。表明本次研究中培养的微球体可能具有一定的干细胞特性，且成纤维细胞上清液中的一些生长因子或趋化因子可以直接或者间接与乳腺癌细胞等发生相互作用，对乳腺癌干细胞的分化产生促进作用^[41]。

肿瘤细胞的增殖和侵袭转移等均会受到肿瘤微环境的影响，而肿瘤微环境属于一种局部稳态环境，形成于肿瘤的发展过程中，涉及到炎症细胞和纤维母细胞以及血管内皮细胞和细胞外基质等^[42-44]。多种实体瘤细胞中只有少数肿瘤细胞才能在体外扩增形成克隆，体外可长期培养的肿瘤细胞系(包括MCF-7)中也存在类似的肿瘤干细胞。本次研究中，利用MTT比色法对两种培养液培养的原代细胞及MCF-7细胞生长情况进行测定，发现二者均处于持续生长状态。但对两种培养液培养的细胞生长速度进行比较，可得成纤维细胞上清液培养速度显著快于无血清培养液PCM-2。即提示成纤维细胞上清液中含有的成纤维细胞可能通过分泌大量相关生长因子的方式对乳腺癌细胞生物学活性产生影响。

综上所述，乳腺癌干细胞具有增殖和多向分化的能力，肿瘤细胞产生的生长因子和细胞因子具有促进乳腺癌干细胞样微球体增殖的能力，且成纤维细胞上清液中分泌的一些因子也可以从一定程度上对乳腺癌干细胞样微球体的增殖与分化产生促进作用。肿瘤微环境可以影响乳腺癌干细胞样微球体的生存状态，在对乳腺癌细胞的生长以及介导致瘤效应过程中具有十分重要的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
全文链接：