脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞治疗膝骨关节炎的能力

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.004

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (14): 2149-2154.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.14.004

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脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞治疗膝骨关节炎的能力

吕品雷¹，苏约翰²，曹蕴²，汪铮^1，2

¹上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所，上海市 200001；²解放军第455医院，解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室，上海市 200052

修回日期:2015-03-18 出版日期:2015-04-02 发布日期:2015-04-02
通讯作者: 汪铮，博士，副研究员，主任，上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所，上海市 200001；解放军第455医院，解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室，上海市 200052
作者简介:吕品雷，男，1989年生，江苏省涟水县人，汉族，上海交通大学医学院在读硕士，主要从事干细胞相关研究。
基金资助:
上海市科委浦江人才计划项目(09PJ1407300)；国家自然科学基金项目(30971468)

Treatment of osteoarthritis using colony-forming cells in stromal vascular fraction of adipose tissue

Lv Pin-lei¹, Su Yue-han², Cao Yun², Wang Zheng^{1, 2}

¹Institute of Digestive Diseases, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China; ²Stem Cell Laboratory, Translational Medicine Base for Biological Cell Engineering Technology, Nanjing Military Region, the 455^th Hospital of PLA, Shanghai 200052, China

Revised:2015-03-18 Online:2015-04-02 Published:2015-04-02
Contact: Wang Zheng, M.D., Associate researcher, Institute of Digestive Diseases, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China; Stem Cell Laboratory, Translational Medicine Base for Biological Cell Engineering Technology, Nanjing Military Region, the 455th Hospital of PLA, Shanghai 200052, China
About author:Lv Pin-lei, Studying for master’s degree, Institute of Digestive Diseases, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China
Supported by:
Pujiang Talent Program of Shanghai Science and Technology Commission, No. 09PJ1407300; the National Natural Science Foundation of China, No. 30971468

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪组织消化后得到的血管基质部分是多种细胞的混合体，其中以克隆样生长的细胞组分可能是真正具有“干性”维持能力的脂肪间充质干细胞。

目的：分离、传代、培养脂肪组织血管基质部分中的克隆形成细胞，并检测其在动物模型中修复膝关节软骨的能力。

方法：培养新鲜分离得到的脂肪组织血管基质部分，挑选其中以克隆样生长的贴壁细胞，消化、传代、培养至第3代。通过手术建立骨关节炎兔模型，将第3代克隆形成细胞移植入模型兔关节腔，与未进行细胞移植治疗的模型兔进行比较，观察兔膝关节软骨的再生情况。

结果与结论：脂肪组织中血管基质部分细胞接种后第3天，贴壁细胞中出现克隆样生长的细胞集落，生长至第5天时，克隆样生长的细胞集落数和周围的单个细胞数均增加，传代至第3代时，仍然呈克隆样的集落生长，梭形形态。大体观察和MRI检查此类克隆形成细胞能在关节腔内帮助软骨修复，增加滑液分泌，同时有助于控制炎症，溃疡面积呈缩小趋势。实验结果有助于优化脂肪间充质干细胞的体外分离、培养体系，并为临床上治疗骨关节炎提供了新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 脂肪干细胞, 血管基质部分, 脂肪间充质干细胞, 克隆形成细胞, 体外扩增, 骨关节炎, 细胞移植, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: Stromal vascular fraction digested from adipose tissue is a mixture of a variety of cells, and clone-like cell components may have the real ability to maintain the stemness of mesenchymal stem cells

OBJECTIVE: To separate, passage and culture colony-forming cells in the stromal vascular fraction of adipose tissue, and to test its ability to repair the knee cartilage in animal models.

METHODS: Stromal vascular fraction isolated from fresh adipose tissue was cultured to collect clone-like adherent cells that were subject to digestion and passage until the third generation. A rabbit model of osteoarthritis was established surgically, and the third generation of colony-forming cells were transplantated into the articular cavity of model rabbits. Model rabbits with no cell transplantation served as controls. Cartilage regeneration in the knee joint of model rabbits were observed and compared.

RESULTS AND CONCLUSION: At 3 days after transplantation of stromal vascular fraction cells, clone-like cell colonies appeared in adherent cells; at 5 days, the amount of clone-like cell colonies and surrounding single cells were both increased. At the passage 3, the clone-like cell colonies were also visible, which were fusiform in shape. Gross observation and MRI examination showed that these colony-forming cells could promote cartilage repair in the joint cavity, increase secretion of synovial fluid, and help to control inflammation and narrow ulceration area. Experimental findings are beneficial for optimizing the isolation and culture of adipose-derived mesenchymal stem cells and provide a new way for the clinical treatment of osteoarthritis.

全文链接：

Key words: Adipose Tissue, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Osteoarthritis

中图分类号:

R394.2

吕品雷，苏约翰，曹蕴，汪铮. 脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞治疗膝骨关节炎的能力[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(14): 2149-2154.

Lv Pin-lei, Su Yue-han, Cao Yun, Wang Zheng. Treatment of osteoarthritis using colony-forming cells in stromal vascular fraction of adipose tissue[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(14): 2149-2154.

图/表（结果） 2

2.1 兔脂肪血管基质部分中原代克隆形成细胞的形态 分离新鲜兔脂肪组织获得血管基质部分，接种后24 h内细胞贴壁。培养3 d时，增殖的贴壁细胞中出现克隆样生长的细胞集落，见图1A，2A。集落内部细胞形态较小，呈多边形；集落边缘细胞形态较长，呈梭形。

培养5 d时，非克隆样生长的单个细胞数量也已较多；细胞集落较3 d时形态更大、更密实，见图1B，2B。当集落中细胞数大于100或集落间发生接触现象时，立即挑取克隆进行消化传代。

2.2 兔脂肪血管基质部分中克隆形成细胞的增殖情况 将兔脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞挑选出来传代培养至第3代，细胞增殖能力旺盛，多呈梭形，但仍存在大量细胞呈集落形态分布，见图3。

2.3 实验动物数量分析 共8只成年雄性新西兰大白兔，模型组3只，实验组3只，正常组2只。模型组和实验组通过改良Hulth法进行手术造模，手术过程中以及手术成功后均未见异常现象发生。

2.4 细胞移植前后膝关节大体观察结果 正常组关节软骨外观呈浅蓝白色，半透明；关节面光滑平整，光泽明亮，无裂纹及软化灶；关节边缘规则齐整，无骨赘形成，见图4A。通过手术将兔后肢膝关节部位前后交叉韧带及内侧副韧带切断，完整切除内侧半月板，造成膝关节运动不稳定。术后驱赶12周后，模型兔膝关节内滑膜大部分呈结节样增生，滑液量少混浊，表面有重度裂纹及溃疡形成，多达骨质，软骨下骨暴露，有大量骨赘形成，见图4B。关节腔内细胞移植4周后，模型兔膝关节面较移植前平滑，滑液量增加，溃疡面缩小，见图5。

2.5 MRI检测骨关节炎模型兔的膝关节修复情况 通过MRI成像系统可以清楚地看到，正常组兔的膝关节中存在半月板，而模型组和实验组兔中均不存在半月板；模型组兔关节面软骨有明显的磨损迹象，软骨较薄，胫骨头后侧有明显骨赘形成；实验组兔移植细胞治疗后，关节面软骨较模型组增厚，且较光滑，见图6。

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引言

骨关节炎是临床中常见的疾病，老年患者所占比例很高，中国患病人数高于8 000万^[1]。骨关节炎是一种退行性疾病，由关节软骨完整性破坏及关节边缘软骨下骨板病变引起，临床表现包括关节疼痛、活动受限，以及周围组织炎症。关节软骨受损后再生修复能力有限，药物治疗效果较差，外科治疗如清创、钻孔减压，虽能暂时缓解疼痛，但仍会以失败告终^[2]。使用骨膜移植和自体软骨细胞移植等来修复关节软骨损伤，不仅受到供者来源的限制，提取的部位也会由于软骨缺损形成新的骨关节炎。而异体软骨细胞的免疫原性也不可避免地限制了其在组织工程方面的应用^[3]。随着人口老龄化，骨关节炎患者逐年增多，因此急需一种行之有效的新型软骨修复方法。

间充质干细胞具有分布广泛、免疫原性低、多向分化潜能等优点^[4-5]，在再生医学中是理想的种子细胞^[6-8]。使用间充质干细胞治疗骨关节炎已成为研究热点，并为患者带来了曙光。成体骨髓来源的间充质干细胞是研究较早、较深入的间充质干细胞，但是其取材侵袭性强，对供者伤害较大，细胞的数量和增殖能力随供者年龄增长而显著下降，且体外培养的早代老年人骨髓来源间充质干细胞会出现提前衰老现象，分化存在不均一性，分化效率低，这些因素限制了骨髓间充质干细胞在临床上的应用^[9-11]。脂肪和骨髓同属中胚层来源，相对于骨髓间充质干细胞，脂肪间充质干细胞更易于获得，供者创伤小，细胞增殖能力更强，每单位脂肪组织获取的间充质干细胞数量约是骨髓间充质干细胞获取数量的5-50倍^[12-13]，而且脂肪来源间充质干细胞的分化能力要明显优于骨髓来源间充质干细胞^[14]。因此，使自体脂肪间充质干细胞在软骨缺损部位高效、均一地定向分化为软骨是将其安全有效地应用于临床的关键。

从新鲜脂肪组织中获取脂肪间充质干细胞的过程中，首先会分离得到脂肪组织中的血管基质部分(stromal vascular fraction，SVF)，然而，血管基质部分仍是一个混合的细胞群，其中存在未分化的脂肪间充质干细胞、造血细胞、成纤维细胞和上皮细胞等多种细胞。前期研究发现，将血管基质部分接种培养后，在贴壁细胞中存在克隆样生长的干细胞组分，其克隆边缘的细胞呈成纤维样生长^[15]，这种生长方式与胚胎干细胞非常相似，因此推测这种克隆形成细胞(colony-forming cells，CFCs)是脂肪组织中真正具有“干性”维持能力的脂肪间充质干细胞。多向诱导分化培养也证实了包含这种克隆形成细胞在内的脂肪间充质干细胞具有高效、均一的定向分化能力。

目前，用于骨关节炎研究的模型有多种，如自发性骨性关节炎模型：STR/ort小鼠模型和Hartley豚鼠模型；人工诱发模型：Hulth法、关节固定法、关节腔内注射化学物质诱导法和臀肌切断法等^[16]。其中，Hulth法为经典手术造模方式，即从兔膝关节的内侧进入，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带，该方法诱导成功率高，稳定性好，应用广泛，特别适用于减轻骨关节炎病理改变的研究^[17-19]。本研究通过挑取原代脂肪组织血管基质部分中的克隆形成细胞，对其进行扩增培养，检测其体外软骨诱导分化能力，并采用改良后的Hulth法建立兔骨关节炎模型，进一步检测其体内软骨损伤修复能力，为制备人工软骨或通过细胞移植治疗骨关节炎等疾病提供理想的种子细胞。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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材料方法

设计：细胞学实验，形态观察；动物实验，关节软骨修复效果观察。

时间及地点：于2013年9月至2014年8月在上海交通大学医学院附属仁济医院消化疾病研究所干细胞实验室和解放军南京军区生物细胞工程技术医学转化基地干细胞实验室完成。

材料：

实验动物：成年雄性新西兰大白兔8只，体质量2.0- 2.5 kg，由上海交通大学医学院实验动物科学部提供，复合饲料喂养，饲养温度20-25 ℃，湿度65%。将8只大白兔随机分为3组：模型组(n=3)、实验组(n=3)及正常组(n=2)。实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准的条例。

脂肪组织：用2%戊巴比妥钠以2.5 mL/kg的剂量麻醉实验组大白兔，无菌条件下切取两肩胛骨间部位皮下脂肪组织约2 mL。

实验方法：

兔脂肪组织血管基质部分的分离和培养：取兔两肩胛骨间部位皮下脂肪组织，PBS冲洗，剪碎至1 mm³大小，用1 g/LⅠ型胶原酶于37 ℃恒温水浴箱振荡消化60 min至脂肪组织基本液化，2倍量的含体积分数为10%新生牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，于200目滤网过滤以去除残留的筋膜织，PBS重悬细胞，洗涤，1 600 r/min离心5 min，去上清，5倍量红细胞裂解液轻微振荡裂解红细胞10 min， 1 600 r/min离心5 min，去上清，PBS重悬后离心洗涤2次，用脂肪间充质干细胞培养液重悬细胞，取0.2 mL细胞悬液行锥虫蓝染色计算细胞数量和活力，接种于10 mm培养皿，在37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度条件下培养，每3 d换液1次。

显微镜下观察：原代血管基质部分接种后第3天和第5天，于倒置显微镜及相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。

血管基质部分中克隆形成细胞的筛选和培养：细胞贴壁后，显微镜下观察细胞的生长情况以及形态变化，对克隆样生长的细胞集落进行标记。当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，PBS漂洗1次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，置于37 ℃、体积分数为5% CO₂、饱和湿度的培养箱中3 min，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入脂肪间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后，接种于75 mL培养瓶进行培养，至细胞生长至90%融合时，进行消化、传代。培养至第3代时，收集细胞，计数后用于模型兔关节腔内移植。

骨关节炎模型的制作及细胞移植实验：取成年雄性新西兰大白兔8只，麻醉后仰卧于手术台上，无菌条件下暴露膝关节内侧纵切口长约2 cm，显露膝关节，然后切断前后交叉韧带及内侧副韧带，完整切除内侧半月板，保留关节软骨面。术后不固定伤肢，自由活动，术后1周内均给予80×10⁴ U青霉素预防感染。手术后每天驱赶2次，每次15 min，连续12周^[8-9]。

正常组不造模，关节腔内不注射细胞，造模组造模后关节腔内不注射细胞，实验组造模成功后关节腔内注射2×10⁷脂肪血管基质部分中克隆形成细胞。造模组和实验组分别在造模前、造模后和细胞移植后第4周通过大体观察和MRI检查膝关节修复情况。

MRI检查：每例膝关节均进行T2图(T2 mapping)成像：TR 1 000 ms，TE 11.5，23，34.5，46 ms，Aver age 2，扫描时间(TA)：6.52 min，扫描胫骨关节矢状面，观察胫股关节软骨形态及信号，采用4回波SE序列及5回波GRE序列分次扫描。所有扫描序列采用相同的几何学参数(FOV：140 mm×140 mm，矩阵：384×384，相位分辨率：100%，层厚：2.5 mm，层数：12)。扫描完成后传送至工作站，生成T2伪彩图及相应的解剖图像。

主要观察指标：观察脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞的生长状态和软骨分化能力，并考察其体内软骨修复能力。

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讨论

干细胞是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，如成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝细胞和肌肉细胞等^[20-34]。自体脂肪间充质干细胞因其易于获得^[35-38]，增殖能力强，不存在免疫原性等优点^[39-40]，作为组织工程中的新型种子细胞，在临床治疗骨关节炎等疾病中备受关注。

在利用Ⅰ型胶原酶消化法获取脂肪间充质干细胞的过程中，脂肪组织消化后得到的血管基质部分是包含脂肪间充质干细胞在内的多种细胞的集合，如何从中分离出真正具有“干性”维持能力的脂肪间充质干细胞，是保证其移植入体内后能够均一、高效地定向分化为病灶部位所需细胞的关键。课题组在前期研究中发现血管基质部分中存在一种以克隆方式增殖的贴壁细胞，其克隆形态及生长方式与胚胎干细胞极为相似，因此推测该克隆样的贴壁细胞很可能就是真正具有“干性”维持的细胞。本实验采用挑选克隆的方式对此类细胞进行了传代、大量培养。

为了检测脂肪血管基质部分中克隆形成细胞在体内修复软骨损伤的能力，进一步建立骨关节炎模型兔，并采用关节腔移植细胞进行观察。结果发现，此类克隆形成细胞能在关节腔内帮助软骨修复，增加滑液分泌，同时有助于控制炎症，溃疡面积呈缩小趋势，为软骨再生提供较为有利的环境。以上结果有助于下一步优化成体脂肪间充质干细胞的体外分离、传代方式，并为推进临床上通过细胞移植治疗骨关节炎提供新的实验依据。

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