冻融联合优化化学法制备粗大去细胞同种异体神经

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.12.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：异体神经移植修复神经缺损需要面对和解决的是宿主免疫排斥反应问题。因此，如何避免、减轻免疫排斥反应是同种异体神经移植获得成功的关键因素。
目的：探索新的异体神经预处理方法，清除犬周围神经中的许旺细胞和髓鞘，保留完整的基底膜，建立粗大异体神经移植物的预处理方法，获得去细胞异体神经移植物。
方法：取健康成年杂种犬游离双侧坐骨神经，以冻融联合优化化学法对神经进行预处理，光、电镜观察其结构特征，组织学染色及Western blot分析其成分。
结果与结论：预处理后的去细胞神经的延展性和神经外膜的弹韧性良好，许旺细胞和髓鞘被彻底清除，基底膜保留完整，去细胞神经为一没有细胞、髓鞘及其碎片的空的神经基膜管。结果表明该方法有效的清除了周围神经中主要抗原成分许旺细胞及髓鞘，并且保留了促神经再生的重要成分基底膜，可作为制备组织工程化神经较理想的方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

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关键词: 生物材料, 材料相容性, 去细胞同种异体神经, 粗大, 预处理方法, 组织工程化神经

Abstract:

BACKGROUND: Host immune rejection is the main problem for nerve allograft in the repair of nerve defects. Therefore, how to avoid and minimize the immune rejection is the key to the success of nerve allografting.
OBJECTIVE: To develop a new nerve pretreatment method by which Schwann cells and myelin can be removed from the peripheral nerve of dogs while the basilar membrane can be reserved integrally in order to obtain acellular nerve allografts.
METHODS: Bilateral sciatic nerves from healthy adult dogs were taken and pretreated with the combined freeze-thaw and chemical methods followed by microscopic observation of ultrastructural features, histological staining and western blot analysis of its ingredients.
RESULTS AND CONCLUSION: Pretreated acellular nerves with good ductility and excellent epineurium toughness were empty basal lamina tubes with no Schwann cells, myelin and fragments that were all removed thoroughly, but the basilar membrane was fully retained. These findings indicate that the optimized combination of freeze-thaw and chemical methods can efficiently clear Schwann cells and myelin which are the major antigenic components in the peripheral nerve, while preserve the basilar membrane to promote nerve regeneration. Therefore, this method can be an ideal method for preparation of tissue engineered nerves.

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Key words: Peripheral Nerves, Transplantation, Homologous, Schwann Cells

中图分类号:

R318

管树军，王伟，李岩. 冻融联合优化化学法制备粗大去细胞同种异体神经[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(12): 1914-1918.

Guan Shu-jun, Wang Wei, Li Yan. Preparing acellular nerve allografts by combined freeze-thaw and chemical methods[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(12): 1914-1918.

图/表（结果） 5

2.1 犬坐骨神经分组处理后大体观察 sondell法组和冻融联合优化化学法2组大体外观没有区别，呈淡白色，外径及长度无明显变化，有一定的延展性，神经外膜的韧弹性与新鲜神经基本一致，可在无张力下行常规显微吻合。

2.2 犬坐骨神经分组处理后苏木精-伊红染色结果 新鲜神经及冻融联合优化化学法1组可见蓝染的细胞和朗飞结；其他组纵切片上均无任何细胞；sondell法组和冻融联合优化化学法2组红染的神经内膜呈波浪状纵形排列；sondell法组可见基底膜稍紊乱；冻融联合优化化学法3组可见基底膜有不同程度的断裂。见图1。

2.3 犬坐骨神经分组处理后层粘连蛋白免疫组织化学染色结果 新鲜神经及冻融联合优化化学法1组可见黄染的基底膜围绕在髓鞘周围，其他组髓鞘消失，冻融联合优化化学法2组基底膜呈波浪状，sondell法组基底膜稍紊乱，冻融联合优化化学法3组可见基底膜有不同程度的断裂。见图2。

2.4 犬坐骨神经分组处理后甲苯胺蓝染色结果 新鲜神经可见髓鞘呈现一定厚度；sondell法组、冻融联合优化化学法1组可见大部分髓鞘已经崩解或消失，但尚有残留；冻融联合优化化学法2组和冻融联合优化化学法3组髓鞘消失；冻融联合优化化学法2组残留的神经内膜组成网眼状结构；冻融联合优化化学法3组可见神经内膜断裂。见图3。

2.5 犬坐骨神经分组处理后透射电镜观察结果 新鲜神经髓鞘、神经轴突结构完整；sondell法组、冻融联合优化化学法1组可见少量残存的细胞和髓鞘碎片；冻融联合优化化学法2组髓鞘及轴突均消失，可见圆形或椭圆形的基底膜管，基底膜完整；冻融联合优化化学法3组可见基底膜断裂。见图4。

2.6 犬坐骨神经分组处理后Western blot检测结果 髓鞘相对分子质量约为30 000，冻融联合优化化学法2组在此区域未见条带，说明髓鞘成分被去除，sondell法组在此区域条带模糊，说明髓鞘未彻底清除。见图5。

参考文献

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引言

自1878年Albert首次报道人类异体神经移植以来，已有百年多的历史。作为天然材料，异体神经在结构上接近自体神经，具有其他任何移植替代材料不可比拟的优势^[1-2]。然而，影响异体神经移植应用的主要障碍是免疫排斥反应，这往往是导致移植失败最重要的因素^[3]。目前认为影响神经移植免疫排斥反应的因素主要包括两方面，即许旺细胞和基底膜^[4]。

早在1954年，Sanders等提出许旺细胞是宿主免疫排斥反应的主要标靶，这种观点又被许多学者相继证实^[5-6]，Whitworth等^[7]通过体内外实验证实髓鞘也是引起排斥反应的主要成分。Tajima等^[8]对冻融去细胞神经进行组织学、免疫学等研究，证实组成神经三重模型结构的胶原成分及许旺细胞基底板层并不是神经的主要抗原成分，它们引起的免疫排斥反应非常微弱。

周围神经基底膜是由许旺细胞分泌、合成，然后沉积于许旺细胞外形成^[9]，其对许旺细胞的分裂增殖和功能表达有重要意义；基底膜含有的层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等大分子物质以及多种神经营养因子有重要的生物学功能，不仅对神经再生有明显的引导和促进作用，而且为神经再生构建了良好的微环境。

临床长段神经缺损(>3 cm)的修复，目前最有效的方法仍是自体神经移植。但其材料来源有限，常无法满足需求，且取材后对供区的影响不可避免。近年来，学者们在探索应用生物材料制备组织工程化神经支架的同时，仍致力于发展新的异体神经预处理方法^[10]，目的在于消除异体神经抗原性(许旺细胞)的同时保留其完整的结构(基底膜)，并取得令人欣慰的效果^[11]。秦长江等^[12]采用冻融联合优化化学法成功地制备了大鼠去细胞异体神经，作者在此方法基础上加以改良，成功建立了犬粗大去细胞神经移植物，以期为组织工程化天然神经支架的制备提供依据。

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材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：实验于2006年7月至2007年7月在锦州市中心医院完成。

材料：
实验动物：健康成年杂种犬，辽宁医学院附属第一医院手术学实验室提供。

实验方法：

坐骨神经取材：健康成年杂种犬，动物处死后游离双侧坐骨神经，距离梨状肌下缘0.1 cm处将坐骨神经锐性切断，约4 cm长度，共3段，去除神经外膜表面的脂肪和结缔组织，避免过度牵拉。

Sondell法操作步骤：①蒸馏水浸浴12 h。②4.0%TritonX-100溶液处理12 h。③蒸馏水浸浴3 h，进一步脱出细胞碎片。④3.0%脱氧胆酸钠溶液处理神经12 h。⑤重复前述步骤1次。⑥PBS反复充分冲洗后。把萃取后神经放入4 ℃无菌0.01 mol/LPBS(pH 7.2)暂时保存。

冻融联合优化化学法操作步骤：①切取的坐骨神经段立即放入液氮中2 min，随即把神经取出在37 ℃恒温水浴中快速复温2 min，重复前述步骤3次。②置于0.05 mol/L PBS冲洗15 min放入含125 mmol/L sulfobetaine-10的0.01 mol/L PBS，室温摇动15 h。③用0.05 mol/L PBS冲洗15 min，放入含0.6 mmol/L的sulfobetaine-16，0.14% tritonX-200的0.01 mmol/L PBS，摇动24 h。④用0.05 mol/L PBS冲洗15 min，置入含125 mmol/Lsulfobetaine-10的0.01 mol/L PBS摇动7 h。⑤用0.05 mol/L PBS冲洗15 min，放入含0.6 mmol/L sulfobetaine-16，0.14%tritonX-200的0.01 mol/L PBS，摇动15 h。⑥改良法重复②-⑤1次，第5组重复②-⑤2次，0.05 mol/L PBS反复充分冲洗后，最后放入4 ℃无菌0.01 mol/L PBS(pH 7.2)暂时保存。

组织学观察：

组织切片：取上述2条去细胞神经，各切取10 mm、3 mm神经段，另在手术取材时切取10 mm和3 mm新鲜神经作对照。10 mm段行常规石蜡横、纵切片；3 mm段行环氧树脂812包埋，半薄及超薄横切片。

苏木精-伊红染色：各组石蜡切片做常规苏木精-伊红染色，光镜观察细胞、基底膜的结构。

层粘连蛋白免疫组织化学染色：各组石蜡切片按常规方法行免疫组织化学染色，Ⅰ抗为兔抗人层粘蛋白多克隆抗体，Ⅱ抗为生物素标记兔IgG抗体，光镜下观察基底膜。

甲苯胺蓝染色：将各组半薄切片以甲苯胺蓝染色，光镜观察基底膜及髓鞘。

透射电镜观察：各组超薄切片行醋酸铀和拘椽酸铅双重染色，透射电子显微镜下观察神经的超微结构的差异。
Western blot观察：取各组剩余神经段，分别超声匀浆后离心，取上清液做western blot，观察髓鞘成分(相对分子质量30 000)。
主要观察指标：①犬坐骨神经分组处理后大体观察。②犬坐骨神经分组处理后苏木精-伊红染色、层粘连蛋白免疫组织化学染色及甲苯胺蓝染色结果。③透射电镜观察。④Western blot检测结果。

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讨论

目前，在神经预处理方法上主要有三大类，即物理法、化学法和联合应用^[13]。有研究表明，冻融处理可彻底破坏神经内细胞成分且保留完整的基底膜^[14]，但神经组织中仍然存在崩解的细胞碎片，且在植入体内1个月后仍清晰可见，神经再生差。这表明物理方法虽可破坏大部分许旺细胞和髓鞘，降低免疫原性，但未能有效清除细胞碎片及髓鞘的残留物，从而阻碍轴突向远端生长，影响了神经的再生，制约了该方法的应用。

近年来，Sondell等^[15]用Triton X-100溶液和脱氧胆酸钠溶液在常温下交替处理神经，细胞、髓鞘等结构及其崩溃碎片已完全消除，而SCBL得以完整保留，但Hudson等^[10]认为应用Triton X-100和脱氧胆酸钠引起的周围神经基底膜结构破坏较TritonX-200、Sulfobetaine-1和Sulfobetaine- 20严重。其疗效较自体神经移植效果差^[16]。

通过比较几种不同去污剂在去细胞和保留基底膜方面的效果，探索出优化的去细胞异体神经支架制备方案，秦长江等^[12]创新采取冻融联合Hudson优化化学法对鼠坐骨神经进行预处理，组织形态学上表明已达到相应要求，即清除所有细胞、髓鞘及其碎片，保留完整的基底膜；此法制备的去细胞异体神经的抗原性明显降低，移植后免疫排斥反应不明显。该方法去细胞同种异体神经能满意修复一定长度的神经缺损，可以作为自体神经的一种有效替代物^[17-18]。

本实验中，冻融联合优化化学法1次并不能完全清除许旺细胞及髓鞘；而冻融联合优化化学法3次虽可完全清除细胞髓鞘及其碎片，但同时引起了基底膜的严重破坏；sondell法处理后的神经尚有少量细胞及髓鞘的残留，且由于化学去污剂作用强烈，造成了基底膜结构的部分不完整。

实验证明经改良法(冻融联合优化化学法2次)制备的去细胞神经具有良好的韧性，便于手术操作，经苏木精-伊红、甲苯胺蓝染色及透射电镜观察未见细胞成分(许旺细胞)，透射电镜及免疫组织化学检测证明基底膜结构良好并含有层粘连蛋白成分，组织形态学上表明已达到相应要求，即清除所有细胞、髓鞘及其碎片，保留完整的基底膜；Western blot表明已清除与髓鞘相关的蛋白-髓磷脂(相对分子质量30 000)，理论上能够引导宿主许旺细胞沿其内管壁向移植段迁移和增殖，引导和促进轴突向远端生长，避免或极大地降低了免疫排斥反应，其原理是异体神经通过冻融，可先期损害其许旺细胞、髓鞘而基底膜完整性得以保留，在此前提下应用优化化学法更有利于化学去污剂进入细胞内，强化去污剂的去细胞功效，同时冻融法本身就在一定程度上降低了神经的免疫原性，离子去污剂从另一个角度更加彻底地清除了神经的抗原性物质。本法可避免Sondell法和Hudson法等将神经在蒸馏水中长时间浸泡导致的基底膜破坏，同时在时间上较单纯化学法缩短了7-25 h(为61 h，Sondell法需86 h^[15]，Hudson优化化学法为68 h^[10])，可降低无菌操作过程中神经受污染的概率。

物理法与化学法联合预处理的本质是对优化化学法处理神经组织的环节(蒸馏水浸泡)加以改进，使影响去除抗原和保存基底膜的关键性、难控制性因素发生改变，成为可控制点。这不只是两种预处理方法的简单叠加，更重要的是在发挥最大限度地消除抗原性的基础上可有效地保留基底膜的天然结构，使之在桥接长段神经缺损中发挥引导和促进神经再生的作用，对构建良好的神经再生微环境至关重要。特别是在应用组织工程技术修复周围神经缺损还不成熟的今天，具有一定的现实意义。

本方法制备的去细胞异体神经理论上能够促进周围神经的生长，但能否成为有效的神经缺损移植修复材料，仍需要进一步的动物试验和临床研究加以验证。

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