红色荧光基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞：表达21 d对细胞活性无影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.012

中国组织工程研究 ›› 2015, Vol. 19 ›› Issue (10): 1539-1543.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.012

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红色荧光基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞：表达21 d对细胞活性无影响

尹飚，杨逸禧，杨波，王簕，黎双庆，杨富国

广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150

出版日期:2015-03-05 发布日期:2015-03-05
通讯作者: 杨波，主任医师，教授，广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150
作者简介:尹飚，男，1971年生，江西省吉安市人，汉族，2000年解放军第一军医大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事骨关节与脊柱疾病的研究。
基金资助:
国家青年科学基金项目(31200726)；广州市应用基础研究项目(2013J4100101)

Lentiviral vectors with red fluorescent proteins for transfection of human bone marrow mesenchymal stem cells: the red fluorescent protein can express for 21 consecutive days and exert no effects on cell viability

Yin Biao, Yang Yi-xi, Yang Bo, Wang Le, Li Shuang-qing, Yang Fu-guo

Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Online:2015-03-05 Published:2015-03-05
Contact: Yang Bo, Chief physician, Professor, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Yin Biao, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China for the Youth, No. 31200726; the Basic Research for Application of Guangzhou City, No. 2013J4100101

摘要/Abstract

摘要：

背景：掌握转染的最佳感染复数和产生较强荧光强度的时间，可为后期观察人骨髓间充质干细胞在动物模型体内的示踪奠定基础。

目的：探讨HIV-1来源的慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染人骨髓间充质干细胞的可行性。

方法：将第4代人骨髓间充质干细胞分成空白组和感染复数为 2，3，4组，以细胞数5.0×10⁵个接种于12孔培养皿，添加含有体积分数为1%胎牛血清的成人骨髓间质干细胞完全培养基1 mL。调整慢病毒携带增强型红色荧光蛋白感染滴度为1.0×10¹¹ TU/L，加入各组培养皿中病毒液体积分别为10，15，20 µL，感染复数分别为2，3，4，空白组加入10 μL PBS。转染后24，72 h荧光倒置显微镜观察细胞红色荧光表达情况并计算出转染率。

结果与结论：增强型红色荧光蛋白在骨髓间充质干细胞中稳定表达，转染后24 h倒置荧光显微镜下可见红色荧光，72 h荧光达到最强，细胞转染率与感染复数值呈线性增长关系。转染后21 d内，各转染实验组的人骨髓间充质干细胞数量与空白组比较差异无显著性意义(P > 0.05)，以上结果提示采用 HIV-1来源的慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白转染标记人骨髓间充质干细胞是可行的，当感染复数为4时转染效率高并可持续表达至少21 d，且标记后对其增殖活性无影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

全文链接：

关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 慢病毒, 增强型红色荧光基因, 人骨髓间充质干细胞, 转染, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: To grasp the optimal multiplicity of infection (MOI) and the time when stronger fluorescence intensities produce can lay the foundation for tracing observation of human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo in animal models.

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of HIV-1 lentivirus carrying enhanced red fluorescent protein to transfect human bone marrow mesenchymal stem cells.

METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells at passage 4 were divided into blank group and MOI 2, 3, 4 groups. After that, the cells were seeded into 12-well plates at a density of 5.0×10⁵, and cultured in 1 mL complete medium for adult bone marrow mesenchymal stem cells containing 1% fetal bovine serum. The infectious titer of lentivirus-carried enhanced red fluorescent protein was adjusted to 1.0×10¹¹ TU/L. Lentivirus solution 10, 15, 20 μL at MOI=2, 3, 4 were respectively added into the MOI 2, 3, 4 groups, and 10 μL PBS was added into the blank group. At 24 and 72 hours after transfection, the expression of red fluorescence was observed under an inverted fluorescence microscope and the transfection efficiency was calculated.

RESULTS AND CONCLUSION: Enhanced red fluorescent protein expressed stably in bone marrow mesenchymal stem cells. At 24 hours after transfection, red fluorescence could be seen under the inverted fluorescence microscope and achieved the peak at 72 hours after transfection. Within 21 days after transfection, there were no differences in the number of human bone marrow mesenchymal stem cells between the MOI 2, 3, 4 groups and blank group (P > 0.05). These results show that the HIV-1 lentivirus carrying enhanced red fluorescent protein is feasible to transfect human bone marrow mesenchymal stem cells, with the highest transfection efficiency when the MOI=4, which can express at least for 21 days and have no effects on the proliferative activity of labeled cells.

全文链接：

Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Lentivirus Infections

中图分类号:

R394.2

尹飚，杨逸禧，杨波，王簕，黎双庆，杨富国. 红色荧光基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞：表达21 d对细胞活性无影响[J]. 中国组织工程研究, 2015, 19(10): 1539-1543.

Yin Biao, Yang Yi-xi, Yang Bo, Wang Le, Li Shuang-qing, Yang Fu-guo. Lentiviral vectors with red fluorescent proteins for transfection of human bone marrow mesenchymal stem cells: the red fluorescent protein can express for 21 consecutive days and exert no effects on cell viability[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2015, 19(10): 1539-1543.

图/表（结果） 4

2.1 人骨髓间充质干细胞表面标志物鉴定使用流式细胞技术检测人骨髓间充质干细胞表面标志物，结果显示CD29、CD44、CD71、CD105、CD166表达阳性，而CD14，CD34、CD45表达阴性。

2.2 人骨髓间充质干细胞体外诱导成脂分化能力测定第4代人骨髓间充质干细胞经成脂诱导液培养72 h后，细胞出现小脂滴，继续培养10 d后脂滴数量增加并相互融合，细胞呈长梭形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉淀(图1A)。

2.3 人骨髓间充质干细胞体外诱导成骨分化能力测定第4代人骨髓间充质干细胞经成骨诱导培养72 h后，细胞体积增大，呈短梭形。诱导第10天细胞质可见钙质沉积并出现钙结节，经茜素红染色后可呈红色结节(图1B)。

2.4 慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染人骨髓间充质干细胞第4代人骨髓间充质干细胞经过增强型红色荧光蛋白转染72 h后，以荧光倒置显微镜观察各组细胞的红色荧光表达情况。感染复数为2，3，4组转染24 h后在倒置荧光显微镜绿色光激发下可见细胞呈强度稍弱的红色荧光，72 h后各组细胞荧光强度达到最高峰，其中感染复数为4组产生荧光的细胞数量最多(图2)。感染复数为2，3，4组的细胞转染率分别为(28.8±1.2)%，(57.2±3.7)%，(90.2±2.9)%。3组细胞持续培养到21 d后细胞所发出的荧光仍未见明显减弱。空白组无红色荧光蛋白表达。

2.5 慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染对人骨髓间充质干细胞增殖影响在培养第0，7，14，21天利用未转染第4代人骨髓间充质干细胞与感染复数为4的增强型红色荧光蛋白转染人骨髓间充质干细胞作对比，光镜下两组细胞生长状态与形态结构并无太大差异，细胞碎片及死亡细胞数量较少(图3)。MTT法测定感染复数为4组细胞数量与空白组比较差异无显著性意义(图4)。

参考文献

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引言

材料方法

设计：细胞学水平，体外观察性实验。

时间及地点：于2014年8至11月在南方医科大学骨与软骨再生医学重点实验室完成。

材料：人骨髓间充质干细胞、人骨髓间质干细胞完全培养基、人骨髓间质干细胞成脂及成骨诱导液、带有增强型红色荧光蛋白基因的慢病毒(RFP-Lentivirus)购于广州赛业生物科技有限公司，胎牛血清购于美国Gibco公司，胰蛋白酶-EDTA与青-链霉素混合液购于北京索莱宝公司。

实验方法：

人骨髓间充质干细胞传代培养与成脂、成骨分化能力测定：

人骨髓间充质干细胞传代培养：将购入的人骨髓间充质干细胞用胰酶消化1 min后加入37 ℃预热的成人骨髓间质干细胞完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素)并吹打，将其置于15 mL离心管中以 1 000 r/min离心5 min，去上清液，再加入37 ℃预热的成人骨髓间充质干细胞完全培养基，吹打均匀，以1︰2比例传代，接种至25 cm²培养瓶中，置于37 ℃、体积分数为5%CO₂细胞培养箱培养。24 h后更换培养液，以后每隔2 d换液1次，直至细胞长至80%。

人骨髓间充质干细胞体外诱导成脂分化能力测定：第4代人骨髓间充质干细胞经消化离心重悬后进行计数并接种于12孔培养皿，每孔细胞数5.0×10⁵个，共接种5个孔，接种后第2天换人骨髓间质干细胞成脂诱导液，每天更换1次，诱导第10天进行油红O染色。

人骨髓间充质干细胞体外诱导成骨分化能力测定：取第4代人骨髓间充质干细胞经消化离心重悬后进行计数并接种于12孔培养皿，每孔细胞数5.0×10⁵个，共接种5个孔，接种后第2天换人骨髓间质干细胞成骨诱导液，每天更换1次，诱导第10天进行茜素红染色。

人骨髓间充质干细胞的表型鉴定：取传至第4代人骨髓间充质干细胞，待细胞长满90%时进行鉴定。常规消化离心重悬，收集细胞沉淀，PBS洗涤3次，制成1×10⁸ L^-¹细胞悬液。取细胞悬液100 µL加入荧光标记的各表型抗体10 µL孵育，洗涤后上流式细胞仪检测细胞CD29，CD44，CD71，CD105，CD166，CD14，CD34，CD45表面抗原表达。

慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染人骨髓间充质干细胞：取传至第4代人骨髓间充质干细胞，消化离心重悬后平均分成4组，每组细胞数5.0×10⁵，接种于12孔培养皿，每组4个皿。

各组细胞分别添加含有体积分数为1%胎牛血清的成人骨髓间质干细胞完全培养基1 mL。调整慢病毒携带增强型红色荧光蛋白感染滴度为1.0×10¹¹TU/L，加入各组培养皿中病毒液体积分别为10，15，20 µL，感染复数分别为2，3，4，空白组加入10 μL PBS。转染后24，72 h荧光倒置显微镜观察细胞红色荧光表达情况并计算出转染率。转染率(%)=含荧光蛋白细胞数/总细胞数×100%。

慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染对人骨髓间充质干细胞增殖的影响：取传至第4代人骨髓间充质干细胞，消化离心重悬后进行计数，铺入12孔细胞培养板，每孔细胞数5.0×10⁵，培养第0，7，14，21天在光镜下观察细胞形态及数量，采用MTT法检测细胞存活和生长增殖情况。

主要观察指标： ①增强型红色荧光蛋白在人骨髓间充质干细胞中的表达，获得其最佳感染复数值。②人骨髓间充质干细胞增殖情况。

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讨论

人骨髓间充质干细胞易于取材，在体外可长期培养和大量增殖，在适宜培养条件下保持其未分化状态。人骨髓间充质干细胞具有多向分化的潜能，在不同诱导剂下可分化为各种特定细胞。此外，人骨髓间充质干细胞还具有无免疫原性这一特性，植入宿主体内无明显免疫排斥反应，可定向迁移和长期存活，并保持多向分化潜能，这为临床提供很大的便利^[14]。

慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，与一般的反转录病毒载体不同，慢病毒载体基因组(正链RNA)进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白或产生RNAi干扰^[15]。慢病毒载体系统具有高效而稳定的基因转移效率，因而被广泛使用^[16-18]。近年来相继报道了HIV-1慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白基因转染多种细胞的研究。各种研究结果显示，HIV-1慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白转染效率高、效果稳定、不影响靶细胞生物学特性及其功能。本实验使用慢病毒为“自杀”性病毒，病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。

在本次实验中，感染复数为4组细胞产生荧光的细胞数量最多，转染后的细胞在21 d内生长状态与形态结构与未转染组无明显差异，证实慢病毒携带增强型红色荧光蛋白可稳定高效转染人骨髓间充质干细胞，且转染后细胞增殖能力不受慢病毒携带增强型红色荧光蛋白影响。经慢病毒载体系统转染标记的人骨髓间充质干细胞，后期将会与人脐静脉内皮细胞混合并接种到鼠尾胶原中，鼠尾胶原凝固后为鼠尾胶原细胞提供一个三维的生长环境，便于细胞生长和增殖^[19-20]。胶原和纤维蛋白作为支架生成血管的基质具有其独特的创伤修复作用^[21-22]，该基质具有生物降解性，能提供和自身组织一样的三维环境，允许细胞在细胞外基质分布和沉积，也能够分化成任何期望的形状适应组织缺陷大小。支架对于细胞生长不仅具有培养支持作用，而且还可以通过机械的和生物化学的信号渠道影响着细胞的增殖。

人骨髓间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞在适宜条件下混合培养会自发形成有管腔结构的微血管网，3周左右时间可形成广泛稳定的血管网^[23]，而且可以为新骨的生成提供营养物质和调节骨祖细胞的增殖分化^[24]，二者相互作用可以生成血管样结构^[25-27]。可持续表达21 d红色荧光蛋白的人骨髓间充质干细胞，满足了后续试验中将该种细胞植入动物模型中检测其形态学和生物学改变的时间要求。人骨髓间充质干细胞与内皮细胞存在合作与协同关系从而形成新生微血管网^[28-30]，这一点可以通过后期影像学得到证实。HIV-1慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白转染多种细胞转染效率高、效果稳定、不影响靶细胞生物学特性及其功能。在多种细胞共培养的实验中，需要使用荧光标记区别各种细胞以确定在共培养体系中各细胞的形态及对该体系的影响。而近年来关于人骨髓间充质干细胞与多种细胞共培养的实验也逐渐增加，最佳的转染效果能够保证该细胞在实验中被充分观察与评估。本次实验证实，采用 HIV-1来源的慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白转染标记人骨髓间充质干细胞是可行的，当感染复数为4时对细胞生长影响小，转染效率高，这为指导后续实验提供了重要参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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