人肺腺癌干细胞表型与预后的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.009

摘要/Abstract

摘要：

背景：肺腺癌干细胞是肺腺癌确诊的重要实验室依据，但其评估患者预后的价值如何，临床尚未定论。

目的：探讨人肺腺癌干细胞表型与患者预后的关系。

方法：选取2010年2月至2013年1月在新疆医科大学第一附属医院治疗的肺腺癌患者48例，采用免疫荧光法检测患者肺腺癌干细胞表型标志，比较不同表型与患者临床病例特征以及患者预后的关系。

结果与结论：48例肺腺癌组织中均观察到SP-C表达和CCSP表达，具有肺细支气管肺泡干细胞的表型特征，其中34例同时表达OCT4(OCT4⁺支气管肺泡干细胞组)，14例不表达OCT4(OCT4^-支气管肺泡干细胞组)。OCT4⁺支气管肺泡干细胞组和OCT4^-支气管肺泡干细胞组肺腺癌患者的年龄、性别、吸烟史以及肿瘤分期差异无显著性意义(P > 0.05)；OCT4⁺支气管肺泡干细胞组有23例(68%)患者癌细胞转移，明显高于OCT4^-支气管肺泡干细胞组(21%)，差异有显著性意义(P < 0.05)；在腺癌患者年龄、性别、吸烟史、分期以及癌细胞转移等临床病理特征分层中，OCT4^-支气管肺泡干细胞组肺腺癌2年生存率普遍高于OCT4⁺支气管肺泡干细胞组，两组生存曲线差异有显著性意义(P < 0.05)。结果表明人肺腺癌干细胞具有肺细支气管肺泡干细胞表型特征，同时表达胚胎干细胞基因OCT4时，患者预后差，与肺腺癌转移有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 肿瘤干细胞, 肺腺癌, 支气管肺泡干细胞, OCT4, 表面活性蛋白C, 细支气管非纤毛柱状细胞标志蛋白, 预后

Abstract:

BACKGROUND: Lung adenocarcinoma stem cells are a very important marker for diagnosis of lung adenocarcinoma.

OBJECTIVE: To investigate the relationship between human lung adenocarcinoma stem cell phenotypes and patient’s prognosis.

METHODS: From February 2010 to January 2013, 48 patients with lung adenocarcinoma admitted in the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University were enrolled. Lung adenocarcinoma cancer stem cell phenotypes were detected with immunofluorescence method, and the relationship of different phenotypes and clinical characteristics with patient’s prognosis was compared.

RESULTS AND CONCLUSION: SP-C and CCSP expression was observed in the lung adenocarcinoma tissues of 48 cases, possessing the phenotypic characteristics of bronchioloalveolar stem cells. Of the 48 patients, OCT4 was positive in 34 cases (OCT4⁺ group) and negative in 14 cases (OCT4^- group). There was no difference between the two groups in terms of patient’s age, gender, smoking history and tumor stage (P > 0.05). There were 23 cases (68%) in the OCT4⁺ group with cancer cell metastasis, which was significantly higher than that in OCT4^- group (21%; P > 0.05). In the aspects of patient’s age, gender, smoking history, staging and cancer metastasis and other clinical pathological stratification, the 2-year survival rate in the OCT4^- group were generally higher than that in the OCT4⁺ group, and there was a significant difference in the survival curves of two groups (P < 0.05). Human lung adenocarcinoma stem cells have the phenotypic characteristics of bronchioloalveolar stem cells, and meanwhile, if the cells are positive for OCT4, patient’s prognosis is poor and associated with lung adenocarcinoma metastasis.

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Key words: Neoplastic Stem Cells, Adenocarcinoma, Lung Neoplasms

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

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引言

材料方法

设计：细胞水平体外观察实验。

时间及地点：于2010年2月至2013年1月在新疆医科大学第一附属医院完成。

对象：

纳入标准^[10]： ①患者均经病理组织学确诊。②在本院接受外科根治性切除治疗。③患者临床资料保存完好，能全程接受随访。④患者及家属知情同意。

排除标准： ①术前进行过放疗或化疗。②不能全程随访者。

入选肺腺癌患者48例，其中男30例，女18例；年龄51-72岁，平均(62.73±12.14)岁；根据国际抗癌联盟(UICC)标准分期，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期19例，Ⅲ期18例。

方法：

免疫荧光检测：将切除的肺腺癌组织标本进行常规石蜡包埋切片，切片厚度为5 μm，选用二甲苯脱蜡，滴入DNA缓冲液，同时滴入20 g/L蛋白酶K，混合均匀，55 ℃温箱内孵化过夜，PBS冲洗，滴入兔抗人表面活性蛋白C(SP-C)多克隆抗体(Santa Cruz公司，sc-13979)，另一张加入羊抗人细支气管非纤毛柱状细胞标志蛋白(CCSP)多克隆抗体(Santa Cruz公司，sc-5279)，均4 ℃孵化过夜，PBS洗涤，滴加二抗，PBS洗涤，室温染色，PBS洗涤，苏木精复染，封固，镜检。用PBS代替一抗作为阴性对照，激光扫描共聚焦显微镜观察染色结果。

判断标准：SP-C和CCSP阳性表达细胞呈红色，OCT4阳性表达细胞呈绿色，而CCSP与OCT4双阳性细胞呈黄色，核呈蓝色。所有癌细胞在单色荧光切片中呈SP-C红色，如在双色免疫荧光切片中能观察到红色荧光则为OCT4^-支气管肺泡干细胞，如为黄色荧光为OCT4⁺支气管肺泡干细胞，若仅能观察到绿色，则为支气管肺泡干细胞阴性。

主要观察指标： ①观察肺腺癌组织中有无SP-C和 CCSP表达。②分析OCT4⁺支气管肺泡干细胞组和OCT4^-支气管肺泡干细胞组肺腺癌患者的年龄、性别、吸烟史以及肿瘤分期的相关性。③分析肺腺癌患者临床病理特征与肺腺癌干细胞表型生存关系。

统计学分析：应用采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量资料比较使用t 检验，计数资料比较使用χ²检验，生存曲线比较采用log-rank检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肺腺癌发病机制尚不明确，可能与遗传、大气污染、职业以及慢性肺部疾病有关^[10-13]。发病患者病灶多呈圆形或卵圆形，一般无包膜，但不完整，质地硬度中等，切面色灰白^[14]。本病具有高度浸润性及破坏性生长特征，极易侵袭血管及淋巴系统，严重威胁患者生命健康。临床研究显示，肿瘤干细胞是肿瘤实质发生、自我更新、无限增殖的重要因素^[15-17]。但临床对肺腺癌干细胞的表型特征如何，尚无统一结论。国外研究显示，肺癌(包括肺腺癌)干细胞在侧群细胞内呈高度集聚状态，但随后却无相关研究论证^[18-20]。还有学者研究认为，肺腺癌干细胞属于CD133⁺细胞的一种，可表达OCT4，RNA干扰并诱使OCT4沉默后，CD133⁺致瘤能力显著抑制，且患者化疗敏感性显著提高^[21-23]。刘天舒等^[24]研究以CD133作为肿瘤干细胞表面标志，采用流式细胞仪高速分选技术从人肺腺癌细胞株A549中分离肺癌干细胞及普通肿瘤细胞，实时荧光定量聚合酶链反应及Western blot检测肺癌干细胞和普通肿瘤细胞内的Notch信号通路的表达水平，结果显示，较之普通肿瘤细胞，阻断Notch通路传导对肺癌干细胞的生长抑制效果更强，这可能与DAPT抑制了Notch的过高表达对肺癌细胞的负反馈作用有关^[25]。但也有学者持反对意见，认为肺腺癌干细胞并不属于CD133⁺细胞，该学者检测发现肺腺癌干细胞中的CD133⁺与CD133^-亚群致瘤能力并无明显差异，提示CD133⁺与肺腺癌干细胞致瘤无明显相关性^[26-28]。肺腺癌前期病变多表现为立方状或非纤毛柱状细胞异常增生，提示肺腺癌可能与肺脏细支气管肺泡干细胞恶性转化有关^[29]。作者支持肺脏细支气管肺泡干细胞起源学说，并认为肺腺癌细胞内存在的细支气管肺泡干细胞同时具有CCSP及SP-C特征，同时也存在OCT4，该物质可能与肿瘤的自我更新能力有关。

OCT4是POU转录因子的一种，可与靶基因启动因子中的核苷酸八聚体相互作用，并启动相关基因表达^[30]。细胞生物学研究显示，OCT4可与Sox2及Nanog转录因子构成核心调节环，并调控多种基因来完成2 000余种mRNA转录^[31-35]。如选择性敲除上述基因的某个环节，胚胎干细胞的自我更新能力均可能失去^[36]。但敲除OCT4是否影响肺腺癌干细胞自我更新能力，研究尚未证实，这有待继续的研究。有文献报道，人肺腺癌细胞具有支气管肺泡干细胞特征，可同时表达SP-C和CCSP，因此常用SP-C⁺ CCSP⁺双阳性作为腺癌干细胞的标志物^[37-39]。本次研究中发现48例肺腺癌组织中均观察到SP-C表达和CCSP表达，具有肺细支气管肺泡干细胞的表型特征，提示肺细支气管肺泡干细胞恶性转化可能是肺腺癌的根本起源。邵建伟等^[40]在人正常肺组织中可检测到细支气管肺泡干细胞，且在肺腺癌组织中可检测到具有细支气管肺泡干细胞表型特征的癌干细胞，提示人肺腺癌可能源自细支气管肺泡干细胞的恶性转化。但肺细支气管肺泡干细胞恶性转化的机制尚不明确，已知的不典型腺瘤样增生中存在两类显性遗传突变，一类为K-ras癌基因第12外显因子突变，一类为表皮生长因子受体的第19-21外显子突变^[41]。这两类突变占国内肺癌患者的30%左右，提示肺细支气管肺泡干细胞可能通过基因突变来实现恶性转化^[42]。研究还发现OCT4⁺支气管肺泡干细胞组和OCT4^-支气管肺泡干细胞组肺腺癌患者的年龄、性别、吸烟史以及肿瘤分期差异无显著性意义，这表明肺腺癌表型与患者年龄、性别、吸烟史以及肿瘤分期无关。

研究对比两种表型患者的预后情况发现，OCT4⁺支气管肺泡干细胞组有23例(68%)患者癌细胞转移，明显高于OCT4^-支气管肺泡干细胞组的21%；且OCT4⁺支气管肺泡干细胞组2年生存率为70%，明显低于OCT4^-支气管肺泡干细胞组(86%)，两组生存曲线差异有显著性意义。干细胞是恶性肿瘤发生、转移的根源，其表达程度与患者预后密切相关，但OCT4⁺支气管肺泡干细胞型肺腺癌干细胞如何影响患者预后的作用机制尚不明确。最新的研究显示，肿瘤干细胞可从原发肿瘤脱落并进入血液循环系统内，最终扩散至全身，提示干细胞可能通过促远端转移来影响患者预后^[43]。有学者研究发现，肺癌患者外周血内可检测到循环肿瘤细胞，并且该类患者预后相对较差^[44]。

综上所述，人肺腺癌干细胞具有肺细支气管肺泡干细胞表型特征，肺细支气管肺泡干细胞恶性转化可能是肺腺癌的根本起源。此外，当肺腺癌干细胞同时表达胚胎干细胞基因OCT4时，其预后更差，并与肺腺癌转移有关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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