人骨髓间充质干细胞对肝癌细胞的生物学效应

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.10.007

摘要/Abstract

摘要：

背景：肝癌的转移特性是影响预后的关键因素，观察人骨髓间充质干细胞对肝癌转移行为的影响，对于提高肝癌患者的生存期具有重要意义。

目的：探讨人骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞生物学特性的影响。

方法：Transwell下室加入人骨髓间充质干细胞，上室加入高、低转移潜能肝癌细胞悬液，共培养36 h酶标仪检测吸光度值及细胞计数法观察肝癌细胞侵袭能力的变化。CCK-8 法检测人骨髓间充质干细胞对高低转移潜能肝癌细胞增殖能力的影响。PCR检测人骨髓间充质干细胞与高低转移潜能肝癌细胞共培养前后转移相关因子骨桥蛋白、唾液酸蛋白、整合(α-V)以及增殖相关基因转化生长因子β1和程序化凋亡因子的表达。

结果与结论： ①共培养组的肝癌细胞迁移数量显著少于单独培养组，经酶标仪半定量检测肝癌细胞侵袭性显示，共培养组吸光度值明显低于单独培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)。②高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组转移相关因子骨桥蛋白和骨唾液酸蛋白表达显著下降(P < 0.05)，但整合(α-V)基因表达未出现明显改变(P > 0.05)。低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组转移相关因子骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白以及整合(α-V)基因表达显著下降(P < 0.05)。③经酶标仪半定量检测肝癌细胞增殖能力显示，共培养组吸光度值明显高于单独培养组，差异有显著性意义(P < 0.05)。④高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1基因表达显著上调(P < 0.05)；但程序化凋亡因子基因表达无明显改变(P > 0.05)。低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1、程序化凋亡因子基因表达均显著上调(P < 0.05)。以上结果提示人骨髓间充质干细胞与肝癌细胞共培养后，肝癌细胞侵袭能力明显下调，增殖能力明显提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 骨髓干细胞, 肝癌细胞, 人骨髓间充质干细胞, 生物学行为, 侵袭能力, 细胞增殖

Abstract:

BACKGROUND: The metastatic potential of hepatocellular carcinoma cells is key factor influencing patient’s prognosis. To observe the effect of human bone marrow mesenchymal stem cells on metastasis of hepatocellular carcinoma is of great significance for improving the lifetime of hepatocellular carcinoma patients.

OBJECTIVE: To explore the biological effect of human bone marrow mesenchymal stem cells on hepatocellular carcinoma cells with different metastatic potentials.

METHODS: Human bone marrow mesenchymal stem cells and hepatocellular carcinoma cell suspension with high and low metastatic potentials were respectively injected into the Transwell chamber, and after 36 hours of co-culture, ELISA method was used to detect the absorbance value as well as cell counting method was used to observe the changes in the invasion ability of hepatocellular carcinoma cells. The effects of human bone marrow mesenchymal stem cells on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell suspension with high and low metastatic potentials were determined using cell counting kit-8. PCR method was adopted to measure the expression of osteopontin, bone specific sialoproteins, integration (alpha V), transforming growth factor beta 1 and programmed cell death protein 5.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of migrated hepatocellular carcinoma cells was significantly lower in the co-culture group than the single culture group, and based on the semi-quantitative detection of invasion ability, the absorbance value of the co-culture group was significantly lower than that in the single culture group (P < 0.05). (2) The expression of osteopontin and bone specific sialoproteins was significantly decreased in the co-culture group with high metastatic potential (P < 0.05), but there was no change in the expression of integration (alpha V) (P > 0.05). In the co-culture group with low metastatic potential, the expression of osteopontin, bone specific sialoproteins, and integration (alpha V) were declined remarkably (P < 0.05). (3) Results from the semi-quantitative detection of proliferation ability showed that the absorbance value of the co-culture group was significantly higher than that of the single culture group(P < 0.05). (4) In the co-culture group with high metastatic potential, the expression of transforming growth factor beta 1 was up-regulated significantly (P < 0.05), but the expression of programmed cell death protein 5 showed no changes(P > 0.05). However, in the co-culture group with low metastatic potential, the expression of transforming growth factor beta 1 and programmed cell death protein 5 was both increased dramatically (P < 0.05). These findings suggest that the human bone marrow mesenchymal stem cells reduce the invasion ability of hepatocellular carcinoma cells, and enhance their ability of proliferation.

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Key words: Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cells, Carcinoma, Hepatocellular, Neoplasm Invasiveness

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 人骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞侵袭能力的影响人骨髓间充质干细胞与不同转移潜能肝癌细胞共培养组肝癌细胞迁移数量显著少于单纯肝癌细胞培养组，见图1，2。

2.2 人骨髓间充质干细胞与不同转移潜能肝癌细胞共培养侵袭性实验半定量检测结果分析经酶标仪半定量检测，高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的吸光度值为0.142±0.009，单独高转移潜能肝癌细胞组为0.172±0.019，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的吸光度值为0.102±0.009，单独低转移潜能肝癌细胞组为0.131±0.009，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.3 人骨髓间充质干细胞与不同转移潜能肝癌细胞共培养前后转移相关蛋白比较转移相关因子骨桥蛋白和骨唾液酸蛋白在高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养之后均出现表达显著下降的情况(P < 0.05)，但整合(α-V)基因表达未出现明显改变(P > 0.05)。转移相关因子骨桥蛋白和骨唾液酸蛋白以及整合(α-V)基因在低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养之后均出现表达显著下降的情况(P < 0.05)，表明人骨髓间充质干细胞对高低转移潜能肝癌细胞的凋亡影响有差异性，见表1，2。

2.4 人骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞增殖能力的影响经酶标仪半定量检测，高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的吸光度值为0.360± 0.038，单独高转移潜能肝癌细胞组为0.254±0.022，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的吸光度值为0.280±0.032，单独低转移潜能肝癌细胞组为0.197±0.018，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 人骨髓间充质干细胞与不同转移潜能肝癌细胞共培养前后转化生长因子β1、程序化凋亡因子基因表达情况比较经相对定量表达检测，高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1基因显著表达上调(P < 0.05)，程序化凋亡因子基因未出现明显改变(P > 0.05)，见表3。

低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1、程序化凋亡因子基因均显著表达上调(P < 0.05)，见表4。

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引言

材料方法

设计：细胞学体外观察实验。

时间及地点：于2014年11月在解放军第117医院干细胞治疗中心完成。

材料：人肝癌细胞系由上海复祥生物科技有限公司提供，其中MHCC97-L具有低转移潜能，MHCC9-H具有高转移潜能。人骨髓间充质干细胞由上海拜力生物科技有限公司提供。

实验方法：

肝癌细胞培养：以1×10⁴/cm²细胞密度接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养，达到50%融合时更换培养基(含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基)，达到90%融合时进行胰酶消化传代。

人骨髓间充质干细胞培养：以0.5×10⁴/cm²细胞密度接种于培养瓶中，置于37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱中进行培养，达到50%融合时更换培养基(含体积分数为10%胎牛血清的高糖DMEM培养基)，达到90%融合时进行胰酶消化传代。

Transwell法检测人骨髓间充质干细胞与不同转移潜能肝癌细胞共培养的侵袭能力：Transwell小室上室加入 4 ℃预冷2 h的ECM gel 50 μL，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内直至ECM gel凝固为止，然后上室加入100 μL细胞浓度为1×10⁹ L^-¹肝癌细胞悬液，下室加入500 μL含体积分数为20%胎牛血清的培养基和1×10⁴人骨髓间充质干细胞，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂培养箱内培养36 h，酶标仪半定量检测肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养前后迁移肝癌细胞吸光度值变化。然后细胞用0.1%结晶紫染色，显微镜下观察和拍照。

CCK-8法检测细胞增殖能力：待下室细胞均贴壁后，于96孔板上室以每孔2×10³个细胞量进行接种，每孔体积为75 μL；培养48 h之后取出上室板，每孔培养基补足至80 μL并分别加入8 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h后检测吸光度值。

Real time-PCR法检测不同转移肝癌细胞相关因子的表达情况：肝癌细胞(下室)与人骨髓间充质干细胞(上室)共培养48 h后，取下室送检PCR。Trizol试剂进行细胞裂解，提取细胞总RNA并进行纯度鉴定，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，然后经PCR扩增相应的cDNA。PCR产物经电泳、DNA吸光度扫描检测进行半定量分析。

主要观察指标： ①不同转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养前后迁移肝癌细胞数量。②不同转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养后转移相关蛋白表达。③不同转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养后的增殖能力。④不同转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养后转化生长因子β1、程序化凋亡因子基因表达情况。

统计学分析：利用SPSS 17.0软件统一处理研究中得到的所有数据，其中计量资料均用x(_)±s进行表示，予以独立样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

肿瘤干细胞理论认为一位特定患者的全部癌细胞只有一小部分被称为肿瘤干细胞，它们负责形成和维持肿瘤并引发其在体内扩散到远处(转移)^[4-6]。需要专门攻击肿瘤干细胞的治疗方法来减少复发，阻止转移并治疗侵袭性最高的肿瘤。肿瘤干细胞能够自我更新并形成不同的癌细胞亚型，像正常的干细胞一样，可能产生不同的器官和组织^[5-9]。无论何种原因引起的肝癌，肝脏细胞均受到了不同程度的损害，如果能从细胞水平上修复肝硬化，可谓从根本上治疗肝癌。

人体的细胞大多为已经完全分化的细胞，完成相应的工作后即死亡^[10-12]。肿瘤干细胞具有无限增殖的潜能，对肿瘤的存活、增殖、侵袭、转移、复发以及放化疗抵抗等起着关键作用。它能逃逸药物等治疗方法的杀伤作用，常规治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后，肿瘤干细胞又开始无限增殖和分裂，孕育出大量新生的子代肿瘤细胞，周而复始，这也可能是肿瘤无法彻底根除的重要原因^[13-15]。

干细胞根据其来源的不同，分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞因社会伦理问题应用受限。但成体干细胞中的间充质干细胞则不存在来源问题，且具有良好的低免疫原性，因此临床被广泛的应用于各种疾病治疗中^[16-17]。间充质干细胞具有“定向迁徙”和“归巢分化”的能力。干细胞移植到人体后，可以非常有目的性的向受损脏器迁移，并到达受损脏器^[18-20]。国内外大量的临床应用证实，采用干细胞移植方式可以对肝硬化发展产生有效的抑制作用，避免肝癌的出现^[21-28]。

在肝癌的临床治疗过程中，其转移特性会对实际的预后效果产生较大的影响，是治疗的关键所在^[29-31]。因此通过人骨髓间充质干细胞对肝癌细胞转移等生物学行为影响的情况进行分析研究，可以更好的指导临床治疗，促进肝癌患者生存期的延长和生活质量的提高^[32]。国外一些实验结果也显示，肝癌坏死区肝细胞的主要细胞来源为人骨髓间充质干细胞。之后的一些实验也均显示，人骨髓间充质干细胞可以分化成肝细胞或肝样细胞^[33-38]。

本次研究结果显示，人骨髓间充质干细胞可以使不同转移潜能肝癌细胞的侵袭能力出现明显的下调，且增强其增殖能力。研究结果还显示，高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1基因显著表达上调(P < 0.05)，但程序化凋亡因子(PDCD4)基因表达没有显著改变(P > 0.05)，低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养组的转化生长因子β1、程序化凋亡因子(PDCD4)基因均显著表达上调(P < 0.05)。说明人骨髓间充质干细胞对不同转移潜能肝癌细胞的凋亡影响存在一定的差异，分析原因，可能与不同转移潜能肝癌细胞的增殖能力存在区别有关^[39-40]。

在肝癌的转移过程中，细胞侵袭是一个关键的步骤。本次研究结果显示，人骨髓间充质干细胞与肝癌细胞共培养后，可以导致肝癌细胞侵袭迁移能力的显著下降。转移相关因子骨桥蛋白和骨唾液酸蛋白在高转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养之后均出现表达显著下降的情况，但整合(α-V)基因表达未出现明显改变(P > 0.05)。转移相关因子骨桥蛋白、和骨唾液酸蛋白以及整合(α-V)基因在低转移潜能肝癌细胞与人骨髓间充质干细胞共培养之后均出现表达显著下降的情况。表明人骨髓间充质干细胞会对肝癌细胞增殖相关因子以及转移相关因子基因的表达产生一定的影响，并通过上调或者下调相关基因表达而发挥有效干预肿瘤细胞的效果。综上所述，人骨髓间充质干细胞与肝癌细胞共培养后，肝癌细胞侵袭能力明显下调，增殖能力明显提高。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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